克隆及诱导蛋白步骤

1植物RNA提取使用天根植物RNA快速提取试剂盒提取棉花RNA，详细步骤见说明书。核酸分析仪分析RNA浓度1.打开软件ND-1000V3.5.1，选择“Nucleicacid”；2.擦拭加样处，用DEPC水清洗（1μl）之后点击“OK”;3.选择“RNA”，擦拭，再加1μlDEPC水作空白，点击“Blank”；4.擦拭进样口，吸1μlRNA样品，点击“Measure”,记录结果；5.擦拭，吸取1μlDEPC水清洗进样孔，点击“Blank”，再次进样，重复步骤4.6.记录结果:A260/A280;A260/A230;ng/μlA260是核酸最高吸收峰的吸收波长A280是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长A230是碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂的吸收波长A260/A280的比值在1.6~2.0之间，表明没有蛋白质污染A260/A230的比值在2.0~2.4之间，表明没有盐类小分子污染剩余RNA放-80°冰箱保存或继续进行试验2基因克隆根据转录组及基因组注释的目的基因ORF序列，合并同源基因，设计了引物，以期获得全部家族基因。处理的棉花叶片提取RNA，反转录天根快速反转录试剂盒合成第一链cDNA无RNase离心管1.各试剂使用前混匀并短暂离心；2.gDNA去除体系，混匀，短暂离心，置于42℃3min后置于冰上。TotalRNA约1500ng5×Buffer3μlRNaseFreeddH2O补足到15μl3.反转录反应体系10×FastRTBuffer3μlRTEnymeMix4μlFQ-RTprimerMix2μlRNase-Free7.5μlTotal15μl4.取3混合液加到2步溶液中，混匀，并轻微离心；5.42℃孵育15min，95℃孵育3min放到冰上。得到cDNA用于后续试验。-20℃保存。PCR检测模板Taqmix10μlACT-jianceF0.4μlACT-jianceR0.4μlT1μlddH2O8.2μlTotal20μlPCR程序94℃4min94℃30s55℃30s38cycles72℃30s10℃∞做胶，跑胶若条带在400-500bp之间，说明模板可用克隆，P基因或做荧光定量检测目的基因表达上调或下调。（实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。检测方法1.SYBRGreenⅠ法:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性2.TaqMan探针法:探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。）做蛋白功能接下一步Pfu高保真酶5XHFBuffer5μldNTP2.5μlPfu0.5μFP0.5μlRP0.5μlT3μlddH2O13μlTotal25μlPCR程序94℃4min94℃30s℃30s35cycles72℃s10℃∞电泳，若条带符合序列长度，则进行胶回收。胶回收1.在紫外灯下切含目的的基因胶；2.加500μlBufferDE-A混合后75℃6~8min至胶熔化；3.加250μlBufferDE-B混合(目的片段＜400bp，加1体积异丙醇)变黄色，准备DNA制备管，置于2ml离心管中；4.吸取3中混合液于DNA制备管中，离心12000r/min，30s，弃滤液；5.制备管重置2ml离心管，加500μlBufferW1(除去蛋白质)，离心12000r/min，30s，弃滤液；6.加700μlBufferW2(除去离子、盐)，离心12000r/min，30s，弃滤液，弃废液后以同样的方法再用BufferW2(除去离子、盐)洗涤一次，离心12000r/min，1min，弃滤液；(确定在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇，两次冲洗，使用BufferW2能确保盐分被完全消除，消除对酶切反应的影响)7.将制备管置回2ml离心管中，离心12000r/min，空离1min;8.将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中加入20μl去离子水ddH2O,室温静置1min，离心12000r/min，1min,洗脱DNA。（将去离子水加热至65℃，提高洗脱效率）连接PEASY-T3(Blunt)连接快连4μlDNA1μlT3载体室温连接30min,20min时拿感受态细胞（每支100μl，分两管使用）转化1.将trans1-T1感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上10min;2.轻轻吸已连载体，打入50μl感受态细胞中；3.冰上静置30min；4.42℃热激45s，勿动；5.冰上静置5min/2min；6.在超净台上向已经完成转化的离心管中加入500μlA－LB液体培养基；7.37℃200rpm1h涂板1.取出已倒好的板（烧好玻璃棒，凉30min）；2.取10μlAmp＋、40μlX-gal、40μlIPTG在1.5ml离心管中混匀；3.分别取90μl于板上，涂匀；4.取400μl已摇好的菌涂板；5.先正置培养30min,再倒置培养12-16h；6.4℃保存，以备后续试验LB培养基1L1L400mL蛋白胨（Tryptone）10g4g酵母提取物（Yeastextract）5g2gNaCl10g4g琼脂粉（Agarpowder,固体）15g(1.3-1.5%)6g蒸馏水定容至1L/400mL。挑斑：加入200μlAmp+LB于离心管中，用2.5μl枪枪头挑斑，一个枪头一个斑，打入离心管中，每个板挑12个菌，摇菌12h。（挑白斑中等大小，相对在培养皿中部，与蓝斑相近的斑，点的每个斑之间的距离不要太近）菌液PCRTaqmix10μlM13F0.4μl吹打、离心M13R0.4μlT1μlddH2O8.2μlTotal20μlPCR程序94℃6min(环状需要的时间长一些)94℃30s55℃30s38cycles72℃2min10℃∞PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收PCR产物,转化全式金公司Trans1-T1克隆感受态细胞,经菌液PCR检测后送公司测序。序列正确后以备后续工作。3原核表达根据目的基因的ORF序列设计双酶切引物构建目的基因-pET30a融合表达载体。GhTPS-pET30a融合表达载体构建的具体步骤如下:(1)根据GhPS的ORF序列(去信号肽)设计双酶切引物GhPS-F和GhPS-R,(2)PCR扩增后,将扩增产物及pET-30a分别用引物序列中所示内切酶进行酶切:10×MBuffer2μL10×MBuffer2μL内切酶11μL内切酶11μL内切酶21μL内切酶21μLGhTPSPCR产物10μLpET-30a10μLddH2O6μLddH2O6μLTotalvolume20μLTotalvolume20μL金属浴中37°C消化2h后用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测;(3)使用AxyprepTMDNAGelExtractionKit回收目的产物;(4)将回收的目的片段连接至pET-30a片段:2×T4ligaseBuffer5μLT4DNALigase1μLpET-30a双酶切片段1μLGhTPS双酶切片段3μLTotalvolume10μL慢连金属浴中16°C连接过夜;(5)将连接产物转化到全式金公司Trans1-T1克隆感受态细胞中,菌液PCR检测后,挑选阳性克隆送公司测序;(6)测序正确的菌液提取质粒,转化到博迈德公司表达细胞Rosetta(DE3)中,菌液PCR检测和测序后,在测序正确的菌液中加入甘油,保存菌种于-20°C或直接用于融合蛋白的诱导表达。3使用IPTG诱导融合蛋白的表达,具体步骤如下:(1)小量表达蛋白以确定最佳诱导IPTG浓度:吸5μL保存的菌种加入到5mLKan抗性的液体LB,恒温摇床中37°C,220rpm过夜培养。第二天按1:100比例将菌液加入到5mL新的Kan抗性液体LB中,在恒温摇床中37°C,220rpm培养2-3h。当细胞达到对数生长期,加入不同浓度的IPTG诱导蛋白表达,37°C,150rpm振荡培养5-8h。(2)大量表达蛋白:吸5μL保存的菌种加入5mLKan抗性的液体中,在恒温摇床中37°C,220rpm过夜培养。第二天按1:100的比例将菌液加入到400mL新的Kan抗性液体LB,在恒温摇床中37°C,220rpm培养2-3h。当细胞达到对数生长期,按1:1000的比例加入400μLIPTG,18°C,150rpm继续培养20h。然后，10000rpm,4°C离心10min,倒掉上清,用4mL抽提缓冲液extractionbuffer(50mMMopso,pH7.0,5mMMgCl2,5mMsodiumascorbate,0.5mMPMSF,5mMdithiothreitol和10%v/vglycerol)吹打悬浮菌体。超声波进行破碎,5s破碎一次,破碎5min,然后16000rpm,4°C离心20min,分别收集上清和包涵体。5酶活性鉴定分别以NPP、GPP、FPP和GGPP为底物,Agilent2ml的螺纹盖进样瓶中加入下列反应体系:Mops(pH7.0,200mM)100μLdithiothreitol(1M)2μLglycerol(100%v/v)200μLMgCl2(100mM)200μLMnCl2(100mM)1μLNaWO4(100mM)4μLNaF(500mM)0.4μLNPP/GPP/FPP/GGPP30/3.7/4.3/4.5μLH2O216.3/242.6/242.0/241.8μL纯化的蛋白溶液500μLTotalvolume1mL加入500μL正己烷收集酶活产物,用封口膜密封进样瓶。恒温水浴锅30°C水浴1h。涡旋并离心,吸200μL上清，使用0.22μm有机滤膜过滤,转移至新的进样瓶,封口膜密封,放入-20°C冰箱保存或直接吸取1μL进行GC-MS定性与定量检测。6GC-MS分析方法使用岛津单四极杆气质联用仪(GCMS-QP2010SE)进行挥发物定性定量分析。毛细管柱为Rxi-5SilMS(30m×0.25mm×0.25µm,RESTEK,USA)。载气为He,进样口温度为250°C,不分流,进样口流速和柱流速分别为10mL/min和1mL/min。进样量1μL,程序升温为:40°C(保持1min)以4°C/min升到130°C(保持5min),以10°C/min升到250°C(保持5min)。MS工作条件:GC分离出的挥发物依次进入四极杆质谱,电离方式:EI70ev,He作为载气,流速为1ml/min,源温和传输线温度都为250°C,扫描范围50-650amu,扫描速度2500amu/s。挥发物组分的定性通过比对NIST图库中的质谱图完成,各组分的定量通过其峰面积与内标癸酸乙酯的峰面积的比较进行折算完成。