免疫共沉淀-研究生实验课.

免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）背景•据估计，人体中大约总共可产生500,000种蛋白，而单个细胞可以产生10,000种。•在这些蛋白中，80%不是以独立的方式存在的，而是存在于一个蛋白复合体中。•蛋白-蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中，我们形象地称之为通过节点（nodes）连接的枢纽（hubs）。蛋白的相互作用•StandardTechniquesGlutathione-S-TransferaseFusionProteinsAffinityTagsTandemAffinityPurification(TAP)TagsStrep-TagIIIQuantitativeProteomicsChemicalCrosslinkingTwo-hybridYeastPhage-display•UniversalVerificationofInteractionTechniquesCo-ImmunoprecipitationConfocalMicroscopy•BiophysicalVerificationofInteractionTechniquesFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)GFP-ProteinProximityImagingMicroscopy(GFP-PRIM)MassSpectroscopy(MS)AtomicForceMicroscopy(AFM)SurfacePlasmonResonance(SPR)实验目的•学习并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法，了解免疫共沉淀结果分析。•了解与免疫共沉淀相关的实验及进展免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。金标准用途：测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。概念及用途bindingwashelutionYY当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。实验原理人脑微血管内皮细胞培养于直径为6cm的培养皿，培养大约90%以上融合后，倒掉培养液，PBS洗3次；加入1mlLysisBuffer（20mMTris,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMEGTA,1%TritonX-100,1mMβ-Glycerolphosphate,1mMNa3VO4,Cocktailproteinase，pH7.5），冰上放置30min，裂解细胞；实验步骤采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100)。每种细胞的裂解条件不一样，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)。为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。Na3VO4作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。因此在做磷酸化的信号转导时需添加。将裂解液转移至EP管中，4℃转鼓摇15min，14000g4℃离心15min；吸取上清液到新EP管中，每管加1μg对照兔IgG，同时加入ProteinAagarose，4℃转鼓转30min，4℃10000g离心5min；preclear及其作用一抗和相应来源的normalmouse,rat,rabbitorgoatIgG中有相同或相似的成分(如无关IgG),用一抗相应来源的IgG与蛋白裂解液和proteinA－agarose可以去除一抗中无关IgG对蛋白裂解液中物质的非特异吸附,二是可以去除蛋白液中与proteinA－agarose非特异结合的物质。做preclear的IgG是不针对特异性抗原的。琼脂糖珠的选择SEPHAROSE是注册商品名,本身是agarose做的凝胶。转移上清液至一新管中，将每管总蛋白定量至500-2000(250-1000)μg，用lysisBuffer将体积补齐至600-800μl。加入AKT兔抗人多克隆抗体10μl，4℃转鼓过夜(10min)；孵育液体积的控制：考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲液太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。加入35μlProteinAagarose，4℃转鼓转2h(10min)；1000g4℃离心5min，PBS洗3次，加入40μl2×SDSSampleBuffer（125mMTris•ClpH6.8,4%SDS,20%Glycerol,100mMDTT,0.02%溴酚蓝）沸水浴中煮沸5min；WesternBlot检测样品，剩余样品-20℃保存。抗体的选择：1.使用明确的抗体：实验最需要注意的就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免疫细胞化学染色能结合未必能用在IP反应。仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题，确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；2.使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG3.抗体用量的控制：1-4μg（通常用2μg）4.确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。优点1.相互作用的蛋白都是经翻译后修饰的，处于天然状态；2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；3.可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点1.可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用2.两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；3.如用westernblot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果（但如果结合质谱检测就可以分析所有的结合蛋白的种类）。通过质谱确定捕获的蛋白结果分析1.盐离子浓度影响coIP结果很多蛋白复合体对盐浓度敏感，但敏感性有强弱之别。通常来说，真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐（0.15M）或更高浓度，即在生理盐浓度下不会解体。具体如，某种CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高盐而不解体。因此，了解一个蛋白复合体对盐浓度的耐受，既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存在的一个重要依据，更是一个非常重要的生化数据；对某些体外生化反应的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助依据。在生理盐或更低盐浓度下进行coIP可能增加假阳性几率—很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。通常选择0.15-0.3M做细胞裂解。纯化蛋白通常选取0.6M以上进行IP。2.过表达血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别（其实也是一种相互作用），同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起，也可以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用。3.不添加NP40一类表面活性剂，削弱对非特异性结合的拮抗NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效拮抗非特异性的蛋白相互作用，提高coIP的特异性。通常IP体系中NP40含量0.2-0.5%。NP40在0.5-1.0%时，染色体很容易析出，造成样品过粘而需要超声。4.超声和冻融的影响很多市售或自制的裂解液过于温和，需要考虑采用机械或者超声等手段提高裂解效率（超声要慎用，可能破坏弱的相互作用）。但是，有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的相互作用，所以不太建议冻融裂解液——即最好裂解液制备好后立即进行coIP。如果证实冻融无影响可考虑将蛋白样品保存-80度待用。5.Tag的影响His-tagged主要用于纯化蛋白。用His-tagged蛋白进行coIP存在潜在的隐患。因为很多蛋白会有富含histidine的domain，遇到效价非常好的抗体会使很多内源性的蛋白都被该抗体识别。造成coIP的假象。TAPtag不能用于分析钙调信号通路。TAPtag实际上从成本角度和Histag差不多，洗脱试剂价格低廉，因此可用于质谱分析，能获取最全面的相互作用的信息。然而由于其中包含钙调蛋白和蛋白A的相互作用domain，天然会结合钙信号相关蛋白，从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的相互作用，有一定的应用局限。Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然会有天然的干扰，应用略有局限；相较后两者是人工合成专门用于tagged蛋白（有相应的专利，因此目前无论抗体或交联好的beads价格都非常昂贵），因此干扰最小、最常用。如需进一步细致区分，a-Flag效价比a-HA略高，因此更适合IP。tag的位置。将tag构建到蛋白的N端还是C端，也是一个潜在的能够影响coIP结果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信号肽，如果将tag构建到N端，则外分泌时会被信号肽酶连同信号肽一起切除；所以这时必须构建在C端。再如，多数蛋白的C端是疏水区，有的时候将tag构建在C端会影响蛋白原来的空间结构，如恰好C端同时是相互作用的结构域，某些时候还可能被遮蔽，从而干扰相互作用。因此，通常构建质粒的时候是N端、C端tagged同时分别构建，以备万一。更高效的方法使用Dynabeads®蛋白A或G进行免疫沉淀反应Dynabeads磁珠vs琼脂糖珠分离纯化蛋白质注重品质和特异性，而非数量。此时，磁珠是最佳的选择。常见问题及解决策略1.目的蛋白分子量比预期大？至少两种可能性是存在的一个是在所谓“摇”的过程中，目的蛋白被修饰。正常的细胞中有很多departments，每个department都有特定蛋白的存在，比如线粒体蛋白、溶酶体蛋白、叶绿体蛋白、内质网结合蛋白、核蛋白；一旦细胞被匀浆化，各个departments就不存在了，每个蛋白都会与其他所有蛋白有接触的机会，所以，发生一些unexpected修饰（或切割）是正常现象。再有一种可能是B蛋白只能结合被修饰的A蛋白，从而在免疫沉淀的过程中富集了这种被修饰的A蛋白。2.背景深条带多，特异性差。最简单的改进方法：换特异性高的抗体，最好用单抗。如果不换抗体，还可以改进共沉淀的条件，例如孵育的温度，孵育的时间，抗体的浓度等等。另外，曝光的时候，时间不要太长，可以降低背景。也可能是抗体浓度过高，可以降低抗体作用浓度。3.没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或者检测得到的信号太弱裂解液中的去垢剂浓度过高或者配方过于剧烈：降低去垢剂浓度或者更换去垢剂种类（按作用剧烈程度来区分:SDSTritionNP40DigitoninCHAPS）受蛋白的亚细胞定位影响：重新选择裂解液配方以释放目的蛋白蛋白之间的相互作用太弱或者不太稳定：选择亲和力更高的抗体以捕获更多的目的蛋白从而捕获更多的相互作用蛋白;过表达提高目的蛋白的含量；选择目的蛋白或者相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验相关技术•体外免疫共沉淀（TnT试剂盒，promega）•免疫沉淀（immunoprecipitation）利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。•Pulldown利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将诱饵蛋白与标签结合，再固化在吸附介质上，之后将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来的方法。除了常用的GST-pulldown，还有生物素标记蛋白-pulldown，His-pulldown等。Glutathione-S-TransferaseFushionProteins(GST-PullDownAssays)局限性：完全是体外实验结果将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂GTH（Glutathione）,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。ThankU