免疫磁珠平台建立

1磁免疫层析平台的建立本实验采用超顺磁性纳米颗粒代替胶体金作为标记物质，EDC/NHS偶联法偶联抗体或抗原，分别建立了单价免疫层析平台和多价免疫层析平台，免疫磁珠不论在均一性还是稳定性上都超过了传统的胶体金，而且通过EDC/NHS偶联法偶联抗体或抗原，不仅偶联效率高，而且由于是物理结合，故结合比较牢固。通过对组成试纸条的各部件优化并处理不仅能达到传统的胶体金试纸条定性的效果，而且还能通过磁信号检测仪轻松测定试纸条T/C线上免疫磁珠磁信号强度，进而对尿液样品中HCG的量进行分析。经过检测临床样本证实，磁性免疫层析的分析结果具有高特异性，高敏感度，建立的多价免疫层析平台还可同时检测两种或多种蛋白。方法2.1单价磁免疫层析平台的建立2.1.1HCG快速检测免疫层析芯片平台的建立2.1.1.1HCG层析试纸条系统的构建2.1.1.1.1样品垫的制备样品垫是经过样品垫处理液（0.5%TritonX-100+0.5%BSA溶于0.01MPBS中，pH7.4）预处理的玻璃纤维素膜。2.1.1.1.2结合垫的制备将制备好的磁珠用Biodotairjet喷头均匀喷于玻璃纤维膜上，或直接用移液器取4-8μl的磁珠点在结合垫上，在20-25℃下通风干燥2-5h，制成免疫磁珠垫。2.1.1.1.3磁性免疫层析试纸条的组装室温下，在PVC板上将制备好的样品垫，结合垫，NC膜及吸水垫按次序搭接（2mm），在Biodot高速试纸条斩切机上切割成4mm宽的试纸条，存放于密封袋中，并装入少量干燥剂存放于4℃冰箱。2.1.1.2HCG免疫磁珠的制备1)取2mg磁珠，用500μlPH4-6的10mM的MEST(0.05%Tween-20)缓冲液洗涤3次并重悬于500μlMES缓冲液中2)加入2.5mg的EDC和NHS，室温偶联3-4h。3)用pH7-9的5mM的BST(0.05%Tween-20)缓冲液洗涤磁珠2次并重悬于500BST缓冲液中，再加入50-300μg的anti-HCG-β单抗。20-25℃偶联过夜，期间在垂直旋转混合仪上不断摇动混匀。4)用磁力架吸附磁珠洗涤，加入含有1-10%BSA的BST溶液中，封闭过夜，最后将洗2涤后的磁珠重悬于保存液中。保存缓冲液：(pH9的5mMBST缓冲液，0.05%Tween-20，0.01%NaN3，0.1%BSA)2.1.1.3样本检测将被检血清或尿液平衡至室温，将试纸条平放，在样品垫上加入80-100μl被检样品，5-10min后用磁信号检测仪（MICT）检测试纸条特定位置上的磁信号，根据磁信号得出待测样品中HCG的含量，或直接用肉眼观测条带颜色的深浅，从而判断是否怀孕。2.1.2HBsAg快速检测免疫层析芯片平台的建立2.1.2.1HBsAg层析试纸条系统的构建2.1.2.1.1样品垫的制备将玻璃纤维素膜浸泡于样品垫处理液（0.5%TritonX-100+0.5%BSA溶于0.01MPBS中，PH7.4）中进行预处理后，自然干燥。2.1.2.1.2结合垫的制备将制备好的磁珠用Biodotairjet喷头均匀喷于玻璃纤维膜上，或直接用移液器取4-8μl的磁珠点在结合垫上，在20-25℃下通风干燥2-5h，制成免疫磁珠垫。2.1.2.1.3磁性免疫层析试纸条的组装室温下，在PVC板上将制备好的样品垫、结合垫、NC膜及吸水垫按次序搭接（约2mm），在Biodot高速试纸条斩切机上切割成3mm宽的试纸条，存放于密封袋中，并装入少量干燥剂存放于4℃冰箱。2.1.2.2磁珠标记1)取2mg磁珠，用500μl浓度为10mM的MEST（0.05%Tween-20，pH：4-6）缓冲液洗涤3次，重悬于500μlMEST缓冲液中，加入2.5mg的EDC和NHS，25℃偶联3-4h。2)用5mMBST（0.05%Tween-20，pH:7-9）缓冲液洗涤磁珠2次，重悬于500μlBST缓冲液中，再加入50-300μg的anti-HBsAg标记单抗。20-25℃偶联过夜，期间在垂直旋转混合仪上不断摇动混匀。3)用磁力架吸附磁珠洗涤，加入含有1-10%BSA的BST溶液中，封闭过夜，最后将洗涤后的磁珠重悬于保存液（保存缓冲液：5mMBST缓冲液，0.05%Tween-20，0.01%NaN3，0.1%BSA，pH=9)。2.1.2.3样本检测将被检血清平衡至室温，将试纸条平放，在样品垫上加入80-100μl被检样品，5-10min后用磁信号分析仪检测试纸条特定位置上的磁信号，根据磁信号得出待测样品中HBsAg的含量，或直接用肉眼观测条带颜色的深浅，从而判断血清中是否含有乙肝表面抗原。2.2多价磁免疫层析平台的建立建立以HCG和HBsAg为检测目标的二价免疫层析层析平台，旨在发现多价层析过程中的问题并找出相应对策，为将来的多价层析试纸条的应用建立3基础。2.2.1磁珠标记按2.1.1.2和2.1.2.2的方法将两种免疫磁珠制备好后等体积混合。（保存缓冲液：5mMBST缓冲液，0.05%Tween-20，0.01%NaN3，0.1%BSA，pH=9)。2.2.2二价磁免疫系统的构建2.2.2.1样品垫的制备将玻璃纤维素膜浸泡于样品垫处理液（0.5%TritonX-100+0.5%BSA溶于0.01MPBS中,PH7.4）中进行预处理后，自然干燥。2.2.2.2结合垫的制备将混合好的磁珠用Biodotairjet喷头均匀喷于玻璃纤维膜上，或直接用移液器取4-8μl的磁珠点在结合垫上，在20-25℃下通风干燥2-5h，制成免疫磁珠垫。2.2.2.3二价磁性免疫层析试纸条的组装室温下，在PVC板上将制备好的样品垫，结合垫，NC膜及吸水垫按次序搭接（间隔约2mm），在Biodot高速试纸条斩切机上切割成3mm宽的试纸条，存放于密封袋中，并装入少量干燥剂存放于4℃冰箱。2.2.3样本检测将被检血清平衡至室温，将试纸条平放，在样品垫上加入80-100μl被检样品，5-10min后用磁信号分析仪检测试纸条特定位置上的磁信号，根据磁信号得出待测样品中HBsAg或HCG的含量，或直接用肉眼观测条带颜色的深浅，从而判断血清中是否含有乙肝表面抗原或HCG。3结果3.1HCG层析系统检测结果3.1.1T线抗体浓度选择为了优化T线抗体浓度，在NC膜上分别以1、2、3mg/ml的量将捕获抗体喷于T线，用80ul4mg/ml的标准品进行测试，分别用肉眼和磁信号检测仪器观察颜色变化和磁信号变化。检测结果显示:随着T线抗体浓度的升高，T线磁信号也相应增强,而2mg/ml的浓度具有非常好的稳定性和可重复性3.1.2HCG试纸条磁信号的检测将HCG标准品稀释为2000，1000，500，200，100，50，25，10，1，0.5，0miu/ml的浓度梯度，在标准条件下进行试纸条层析实验，5min后观察各条线的颜色深浅并在15min后应用磁信号检测仪测定各条线的磁信号。检测结果显示，随着样品浓度的升高，T线的颜色逐渐变深，在磁信号检测仪上检测到的磁信号值也逐渐增大，结果表明：磁信号强度与HCG标准品浓度成正比，肉眼能检测到的最低浓度为10miu，磁信号检测结果可以检测到1miu的浓度。3.2HBsAg免疫层析系统检测结果3.2.1缓冲液pH值与表面活性剂的选择和优化经过反复测试不同pH值的磷酸盐（PBS)4和硼酸（BS）缓冲液以及在其中加入不同浓度的离子，最终确定缓冲液：10×PBS+0.5%BSA+250mMEDTA为本实验的最佳缓冲液体系。测试不同浓度的Tween-20和TritonX-100之后，发现加入0.5%-1.0%的TritonX-100可以加快液体的流动速度，不仅可以缩短反应时间，同时还能够起到避免假阳性的作用。3.2.2T线抗体浓度选择为了优化T线抗体浓度，在NC膜上分别以1、2、3mg/ml的量将捕获抗体喷于T线，用80μl4mg/ml的标准品进行测试，分别用肉眼和磁信号分析仪观察颜色变化和磁信号变化。检测结果显示：随着T线抗体浓度的升高，T线磁信号也相应增强，而2mg/ml的抗体浓度具有更好的稳定性和可重复性。