免疫组化总结

1第一章绪论组织化学（histochemistry）也称细胞化学(cytochemistry),是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分或酶活性进行定性、定位和定量研究的科学。第一节组织化学发展的基础扫描隧道显微镜原理：扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）由Binnig等1981年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV－2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。特点：扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1－0.2nm，纵向可达0.001nm。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。应用：利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。使放大倍数可达数千万倍。第三节组织化学技术基本要求一、组织化学的分支和分类:目前组织化学从细胞、亚细胞和分子三个水平，从定性、定位和定量三个层次，利用物理、化学、免疫学和分子生物学原理，揭示着组织和细胞的化学本质。根据显示原理，组织化学技术大致可分为以下几种类型：①化学方法：根据化学反应原理。在组织切片上生成沉淀以表示其定性定位的存在。绝大部分的组织化学方法都属于此类。如磷酸酶等。②类化学方法：如Best胭脂红显示糖原；Mayer姻脂红显示糖蛋白。虽然染色反应有特异性，但机制尚未完全阐明。③物理学方法：荧光分析法、组织吸收光谱法、X射线显微分析法、放射自显影技术、图像分析、电镜细胞化学、能谱分析等。④显微烧灰法：对组织中无机物质和微量元素的测定。⑤免疫学方法：利用免疫学原理与其技术研究细胞的化学成分。如免疫组织化学、免疫电镜等。⑥分子生物学法：原位杂交组织化学技术等。二、组织化学技术的基本要求:1．保持良好的组织和细胞形态结构，保持组织和细胞生前的化学成分和酶的活性，防止组织自溶，使反应的产物不易位、不弥散，保证反应产物定位精确。2．反应产物具有可视性，即反应产物必须呈现颜色，而且必须是有色沉淀，颗粒微细，不被溶解，定位于原位。反应产物具有定量的可能性，即反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系3．所用组织化学方法必须具备一定的特异性，即仅与某种化学成分发生反应，以便获取正确的实验结果。倘若组织化学试剂同时能与二种以上物质反应，则必须有进一步的分析方法。此外还要具备一定的灵敏性，以便含量极微的物质也能被显示出来。4．所用方法稳定并能重复，以利于重复观察和验证。5．设置必要的对照实验，否则难以判断其结果的可靠性。第二章组织化学与免疫组织化学染色样品制备第一节取材一、组织标本取材:准确、快速。达到保持生活状态下组织细胞形态结构的完整性、尽量保持其化学成分和酶的活性，更要保持组织细胞的抗原性不受损。动物取材时应先将动物麻醉再处死，其方法如下：1.乙醚吸入麻醉法2．戊巴比妥钠和乌拉坦麻醉法3．空气栓塞法细胞标本的取材:（一）培养细胞1．贴壁生长的细胞2．悬浮生长的细胞制备细胞悬液，加入离心涂片机内，1000r/min离心2min，细胞即可均匀分布于已涂黏附剂的载玻片上。3.印片法主要应用于活组织标本检查和剖检标本取材。新鲜标本做一剖面，充分暴露病变区，将载玻片轻2轻压于病变区，脱落的细胞便粘附在玻片上。随后立即将载玻片浸入细胞固定液内5~10min，取出后自然干燥，低温保存备用。其优点是简便省时，细胞抗原保存较好；缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞有重叠，影响观察效果。(二)涂片法临床穿刺获取含有细胞的液体（腹水，胸水和心包液）或气管等分泌物可直接涂片，如果液体太多，可离心。制成细胞悬液。第二节固定（fixation）的目的是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞死后发生自溶和组织腐败。固定还能增加组织块硬度，使其更容易切片，使不同的结构更容易染色。一、组织和细胞的固定方法固定方法有物理固定和化学固定两类，物理固定可采用空气干燥（血涂片）、骤冷（在液氮中迅速冷冻）或微波固定等；化学固定有浸润法(immersionmethod)和灌流法（perfusionmethod）。（一）浸润法:浸润法是组织化学和免疫组织化学常用的固定方法，一次要处理许多组织样品时也多用此法。预先需估计固定剂的用量，并在取材前配好固定液。固定液的用量应是样品的40倍，以保证组织充分固定。固定时间可根据所选固定液和组织类型而定。若进行酶组织化学染色，应在4℃短时间固定，固定时间长会导致酶活性减弱，甚至消失。（二）灌流固定法:此法是经血管途径，将固定液灌注到欲固定的器官内，使生活的细胞在原位及时迅速固定，取下组织之后再浸入相同的固定液内继续固定。灌流固定时大动物多采用输液方式，小动物多采用心脏主动脉灌流，如大、小鼠。在灌注固定液前，先用含抗凝剂的37℃生理盐水灌流，冲洗血管内的血液，防止血液凝固阻塞血管。肝脏由鲜红颜色变为浅白色时，即可灌流固定液，灌注速度为5-10ml/min，应在30min内结束灌注并取材，而后将组织浸入相同的固定液中1～3小时。灌流固定对组织结构和酶活性保存较好。二、常用固定剂和固定方法（一）组织常用固定剂和固定方法1．甲醛是常用的醛类固定剂.其特点是组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。（1）10%中性缓冲福尔马林（2）4%多聚甲醛磷酸缓冲液2.丙酮3.醇类4.混合固定试剂(1)Bouin’s液：组织通常在4℃下固定68h。此固定剂对肾脏结构保存不利。(2)Zamboni液：该固定液可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察。固定时间以618h为宜。(3)AAF液（95%-100%乙醇85mL，冰醋酸5ML，浓甲醛10ML）：较常用的固定液。(4)Clarke改良固定剂（100%乙醇75mL，冰醋酸25mL），常用于冰冻切片的后固定。(二)培养细胞常用固定剂和固定方法在固定之前需用37℃预热的PBS轻洗细胞。1.4%多聚甲醛磷酸缓冲液：固定1020min,干燥。2.甲醇：-10℃甲醇固定520min,自然干燥。3.丙酮：4℃冷丙酮固定组织穿透性和脱水性强，抗原保存好，很少用于组织切片，常用于培养细胞和细胞涂片的固定，平时丙酮4℃低温保存备用，临用时，将载玻片插入冷丙酮内5~10min，取出后自然干燥。4.乙醇：95%乙醇脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而固定时间不宜过长（2h内）。乙醇使蛋白变性程度轻，固定后蛋白可再溶解，在染色中孵育时间长的情况下，抗原可流失，并减弱反应强度。5.乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合对组织穿透性极强，即使涂片上含较多的黏液，固定效果仍较好，是理想的细胞固定液。3第三节、包埋和切片一、石蜡包埋（一）包埋前脱水脱水(dehydration)是用梯度乙醇将固定好的组织内的水分脱去。脱水的时间长短与组织块的大小，结构有关。—般过程：70％、80％乙醇可以长期的保存组织，90％乙醇4h，95％4h，100％乙醇(Ⅰ)2h，100％乙醇(Ⅱ)2h。（二）透明常用的透明剂是二甲苯。透明的时间长短与组织的大小、结构有关。一般过程是:二甲苯Ⅰ0.5～1h，二甲苯Ⅱ0.5～1h。应注意脱水和透明的时间一定要充分，否则，不利于浸蜡，易使石蜡与组织之间形成夹层而使切片困难。但时间也不能过长，否则组织变得过硬，不便于浸蜡，且易引起切片时脆裂。（三）浸蜡:经透明的组织入溶融的石蜡中浸透，一般需经三次，每次0.5~1h，其时间的长短与组织大小和结构有关，可以灵活掌握。浸蜡时间不能过长或不足，其结果与脱水、透明不充分或过长结果相似。用于HE染色的标本浸蜡和包埋的温度可限于65℃，而用于免疫组织化学的标本浸蜡和包埋温度不能高于60℃，否则，高温在非缓冲体系下会破坏组织中抗原。因此，最好选择低熔点软蜡（5658℃）。（四）包埋:浸透石蜡的组织块要入新的石蜡中冷却凝固，即包埋（embeding）。包埋时，包埋器中倒入熔化的新蜡，在其凝固之前迅速放入组织块,放入前要分清组织的各个面，将所需断面朝下。包埋有腔组织时，需平放或立放，以获得所需断面。（五）修块:石蜡凝固后，组织便包封在石蜡内。切片前需把包有组织的蜡块修成一定形状，并且把各个面修平，注意不能把蜡边与组织边靠得太近亦不能太远，近则不易连片，远则废刀。在修块时选适当的地方做标记，便于日后辨认。二，切片:良好的切片应无刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。（六）HE染色(1)脱蜡主要用二甲苯脱蜡。过程如下：二甲苯(Ⅰ)15min二甲苯(Ⅱ)15min。(2)梯度乙醇复水过程：100％乙醇(Ⅰ)10min——100％乙醇(Ⅱ)10min——95％乙醇5min——90％乙醇5min——80％乙醇5min——70％乙醇5min(3)水洗把组织片放入自来水中浸泡5min使组织充分水化，并可洗去多余的乙醇。(4)苏木精染色由于苏木精是水溶性的，故要先入水。水化后的组织片直接放入苏木精中浸10---20min，染细胞核。(5)水洗:组织片直接放入自来水中，一则可以洗去多余的苏木精染液，二则可以水化组织，加强苏木精的着色程度(因为苏木精是碱性染料，而白来水也是弱碱性的)。(6)伊红染色:再次水化的组织片直接入伊红染液中，染细胞质l0min左右。(7)水洗:再次入自来水中洗去多余的染液，这时的水化时间要短，因为伊红在水中易脱色。(8)梯度乙醇脱水:70％乙醇片刻十80％乙醇片刻90％乙醇5min——95％乙醇10min——100％乙醇(Ⅰ)l0min——100％乙醇(Ⅱ)l0min(9)透明:过程如下：二甲苯(Ⅰ)10min，二甲苯(Ⅱ)lOmino透明时，时间一定要充足，确保乙醇完全被置换出来，这样可以使组织片透明、清晰。【实验结果】:细胞核染成紫蓝色，细胞质以及细胞外的胶原纤维等成分染成淡粉红色或淡红色，红蓝对比鲜明。若苏木精染色过深，而脱色不足，则细胞质和胶原纤维等成分带有蓝色。若苏木精染色过淡，则细胞核带有红色，对比不鲜明。（七）封片:透明后的组织片，自二甲苯中取出后，用绸布擦去多余的二甲苯，直接滴加中性树胶，然后压上盖玻片即可镜检。注意：1)滴加树胶要快，以免组织干燥影响观察效果2)树胶不用太多，盖住组织即可3)盖玻片时，要用镊子夹住盖玻片，让盖玻片的—端先接触树胶，再轻轻盖好，以防止出现气泡(二)冰冻切片:(frozensection)是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法,最4突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小，冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大，含水量较多的组织中较易发生。1.防止组织中冰晶形成的方法（1）速冻使组织温度骤降，减少冰晶的形成。方法包括：1）干冰-丙酮（酒精）法2）液氮法（2）应用蔗糖溶液2.恒冷箱切片法1，取材:根据研究目的取所需组织(如切取小鼠肝脏1.0X1.0X0.5cm大小的组织块)，用滤纸吸去多余的水分，将组织块平放于用锡纸特制小盒(直径约2cm)或软塑瓶盖内。加适量OCT包埋剂浸没组织，4℃20～30min。2，组织冷冻:将150～200ml丙酮装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和，不再冒泡时，温度可达-70℃，之后将含有组织块的小盒轻轻放到干冰制冷后的丙酮液面上。(注意不要使丙酮进入包埋液中)，待数十秒后组织冻结即可置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。3，切片:切片前1小时将恒冷箱切片机的温度设定为-18℃左右，以备切片。切片时温度以-15～-18℃为宦，温度过低组织易破碎。切片厚度以4～6um为宜。组织切片可直接贴附于载玻片，或贴附于涂有明胶或防脱片剂内载玻片上以减少组织片脱落。切片于室温干燥或风