免疫组化技术.

组织化学技术江苏大学基础医学与医学技术学院卢小东组织化学的基本概念：组织化学：组织水平，对组织内存在的各种物质进行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法•免疫组织化学：基于抗原抗体反应•酶组织化学疾病的病理学研究概括起来主要在基因和蛋白水平上进行的研究。免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平表达的研究。蛋白表达=分布，定位，定量；蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等材料：•抗体：多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异性强。显示物：酶标反应：①碱性磷酸酶（Alkatinephasphotase,AP）AP与不同的底物（萘酚As-Mx、快蓝、快红）作用，可形成不同颜色的终产物。用新品红（Newfuchsine）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。②辣根过氧化酶(Horseradiseperoaidase,)HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。荧光标记：荧光素标记抗体•异硫氰酸荧光素（Fluorescienisothioyarale,FITC）520－530nm•四甲基异硫氰酸罗达明（Teramethylerhodamineisothiecyanata,TRITC）620nm•四乙基罗达明（TeraethylerhodamineB200,RB200）590－600nm胶体金：•指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，•免疫电镜观察主要方法：•直接法：•间接法：经过了第二抗体放大效应PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反应检出。•ABC法：生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具有高度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4个生物素。当生物素标上特定的标记物质后or与抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，而以适当方式显示。S-P法（LSAB）：采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测定细胞和组织中的抗原。Envision：原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRPorAP）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多的HRP分子，使信号有显著提高，敏感性较PAP法，ABC法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方法更省时，简便。以LSAB法为例简单介绍染色步骤：①石蜡切片脱蜡－水；②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min；③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育5min；④加特异性一抗，370C孵育30－60min，or40C过夜；⑤加20ul生物素标记的第二抗体，370C，30min；⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素，370C，30min；⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min；⑧用过氧化物酶基质液（DAB基质液）显色5－15min。在光镜下观察。⑨自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝，梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。免疫组化常见问题的处理：组织材料的处理：固定液为：10%中性福尔马林液；4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；固定时间：8-24hr组织大小：2*1.5*0.3cm防脱片处理：多聚-L-赖氨酸；硫酸铬钾明胶液。增强特异性染色的措施和方法：1）蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化（0.05-0.1%）；b、胃蛋白酶消化（0.4%）。2）热诱导的抗原修复：方法：微波960C,10min；直接加温方法1000C,10min；高压锅1200C,10min；热处理液：0.01mol/LPH6.0柠檬酸缓冲液合适的抗体稀释度：过高，过低均会导致阴性结果。即用型抗体；浓缩型。减少或消除非特异性染色的方法：非特异性染色：原因：方法：对照：阳性对照：用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。阴性对照：用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。染色特异性染色非特异性染色显色部位特定细胞或间质细胞和间质均匀染色或更强显色定位特定，具有结构性无特定部位，无结构性显色程度同一部位呈不同程度显色无分布规律，某一片均匀着色免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可显著区别。阳性细胞的染色特征：①阳性细胞的染色分布有三种：胞浆；细胞核；细胞膜表面②阳性细胞分布：灶性；弥漫性③染色强度不一④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区，胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。对于阳性结果的定量判断：-，+，++，+++等分级和计数统计淋巴细胞标记物：白细胞共同抗原（LCA,CD45）：主要分布于T,B细胞，单核细胞，粒细胞表面。CD20：B细胞标记物。CD45RO、CD3：T细胞标记物。CD57：为自然杀伤细胞的标记物。CD38：为浆细胞的标记物。CD68：主要标记各种组织中的巨噬细胞。神经内分泌标记物：嗜铬素A（Chromogranin,CgA）：存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。突触素（Synaptophysin,Sy）：存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞，神经内分泌细胞中。髓磷脂硷性蛋白（Myelinbasicprotein,MBP）：激素及激素受体类标记：雄激素受体（Androgenreceptor,AR）：雌激素受体（Estrogenreceptor,ER）孕激素受体（Progesteronereceptor,PR）：垂体激素：ACTH,GH,PRL,LH,TSH主要用于垂体腺瘤的功能分类。降钙素（Calcitotin,CT）：甲状腺旁细胞（C细胞）分泌。以上抗体及标记物主要用于疾病的病理诊断和鉴别诊断其联合应用的作用和意义：Keratin＋Vimentin－上皮性肿瘤Keratin＋滑膜肿瘤Vimentin＋间皮肿瘤上皮样肉瘤癌肉瘤Des＋orActin＋肌源性肿瘤CD34＋orFⅧ＋血管性肿瘤Keratin－S-100＋orMBP＋神经鞘膜瘤Vimentin＋LCA＋淋巴细胞AACT＋骨肿瘤、纤维组织细胞肿瘤GFAP＋胶质细胞肿瘤Keratin－NSE＋orSy＋Vimentin－NF－／＋节细胞神经母细胞瘤免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则：①免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HE染色的形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把免疫组化染色作为诊断的“金标准”。②免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。③免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。④免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学为准。电子显微镜技术：透射电镜透射电镜扫描电镜电子显微镜技术透射电镜扫描电镜固定：为了尽量保存样本的原样使用戊二醛来硬化样本和使用锇酸来染色。冷固定：将样本放在液态的乙烷中速冻，这样水不会结晶，而形成非晶体的脱干：使用乙醇和丙酮来取代水。包埋：树脂超薄切片：将样本使用金刚石刃切成薄片。染色：重的原子如铅或铀比轻的原子散射电子的能力高，因此可被用来提高对比度。名词解释：分辨率免疫组织化学技术HE染色问答题：1.石蜡切片主要经过哪些步骤？2.列举观察组织器官细微结构的染色方法，并说明其优缺点