兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验.

兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验XXX实验目的1.学习如何设计实验，训练学生独立设计并完成实验的能力。2.通过从血清中分离、纯化、鉴定血清白蛋白的实验，培养学生综合应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白质的技能，从牛血清中分离提取白蛋白，并鉴定。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质,约占总量的60%，牛血清白蛋白分子量约66.2kDa。它是一种水溶性很强的蛋白,结构稳定,能结合多种小分子,如脂肪酸,胆红素,血红素等,起维持血液的正常渗透压作用.白蛋白分离纯化的意义①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。④基因工程的需要分离纯化的要求1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。分离纯化的一般程序选择材料破碎细胞提取分离纯化分析及鉴定（盐析，离子交换色谱）（电泳）（离心）1.粗提盐析原理:1不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。2影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。操作:1取0.5ml血清2取0.5ml饱和(NH４)２SO４溶液，缓慢滴入，边加边摇。3混匀后于室温中放置10分钟。48000r/min×10min5小心吸取上清液备用，初步获得白蛋白。操作2.脱盐盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分，样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果，所以在用离子交换层析进行细分级前需要脱盐。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。透析原理：通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。操作：①新透析袋用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。②使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间。③在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。放入盛有蒸馏水的大烧杯中，磁子搅拌，于4℃透析过夜,按时更换透析液。④检查透析效果：1％BaCl2检查(NH4)2SO43.纯化离子交换色谱是蛋白质提纯中得到最广泛应用的方法之一。它是以离子交换剂为固定相，利用蛋白带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱的不同，而将混合物中的不同蛋白进行分离的色谱技术。原理：离子交换剂具有带电荷的酸性基团或碱性基团作离子交换基团，通过静电作用与带有相反电荷的离子结合。当流动相中存在其他相反电荷的离子时，就与结合在固定相交换基团上的反离子进行交换。得到纯化的白蛋白++++++AC-AC-AC-AC-AC-AC-0.02MNH4AC++++++蛋白样品---------++++++AC-AC-AC-AC-AC-AC-NH4+0.06-0.3MNH4AC--白蛋白，α、β球蛋白带负电阴离子交换剂三、纯化（阴离子交换层析）洗脱①将脱盐后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/LNH4Ac洗脱30ml。（去掉α、β-球蛋白）②改用0.3mol/LNH4Ac洗脱，检测到蛋白后立即收集三管，15滴/管，编号。（纯化的白蛋白）③再生：0.3mol/LNH4Ac20ml，0.02mol/LNH4Ac40ml原理：蛋白质是两性电解质。当PHPI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PHPI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有数种蛋白质，在同一PH值时，因所带电荷不同，而在电场中的移动速度也不相同，故可用电泳法将其分离。白蛋白等电点低于pH7.0，在缓冲液中（pH8.6）中，电离成负离子，在电场中向阳极移动。本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到白蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。四、醋酸纤维素薄膜电泳检查准备：制作电桥将巴比妥缓冲液(pH=8.6)倒入电泳槽内，两槽缓冲液平衡至同一水平面。两电极槽各放入两层滤纸，一端浸入缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架上，它们的作用是联系薄膜与两极缓冲液之间的中间“桥梁”。操作：点样端1.滤纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板1、润湿：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液（注意不要吸的太干）。2、点样：点样时，先用吸管将3微升血清均匀地涂在点样器表面，再用点样器“印”在薄膜的点样区内，样品呈线状，宽约1-2mm。注意：点样时动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。另外操作过程要防止指纹污染。3、电泳：将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的滤纸上，无光泽面要向下放置，点样端放在阴极，进行电泳。电泳条件：电压90-110V，电流0.4-0.6A，通电60分钟。至氨基黑指示剂迁移至距薄膜底部前沿时,停止电泳。4、染色：电泳完毕，将薄膜浸入染色液（回收）中10分钟，进行染色。5、漂洗：用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每3-5min左右换一次液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。操作中，注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。6、透明：将薄膜用滤纸吸干或吹风机吹干，浸入透明液中，2min立即取出，紧贴：在载物片上，赶走气泡。完全干燥后，薄膜完全透明，可作扫描描或照相，将该玻璃板浸入水中，则透明的薄膜可脱下，吸干水分，可长期保存。结果与分析牛血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白。因为纯化了的样品只有白蛋白，预计一个泳道只有一个条带。电泳图谱上的条带较宽并拖带，由于血清白蛋白可以结合和运输多种不同的分子,如胆红素,脂肪酸,无机物等,会影响白蛋白的构象变化。此外这些小分子本身可能带有的电荷会影响电泳的分离效果。因此可以推断,一些微量杂质与白蛋白结合是造成这种色谱现象的主要原因。1.5cm粗糙面标上学号点样区2cm（－）（+）电泳条带醋酸纤维薄膜电泳的注意事项醋酸纤维薄膜在光下面能明显区分有光泽面和无光泽面。电泳槽中间为正极，两端为负极。染色液请用完后回收到原来的试剂瓶中。漂洗薄膜时，请做到“少量多漂”，即用少量的漂洗液去漂洗薄膜，多漂几次，这样既不浪费漂洗液，还达到了漂洗的效果。醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。缓冲溶液离子强度不应小于0.05或大于0.07。因为过小可使区带拖尾，过大则使区带过于紧密。电泳槽中缓冲液要保持清洁(数天过滤)两极溶液要交替使用；最好将连接正、负极的线路调换使用。通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。作业:撰写实验报告