Clontech的In-Fusion无缝连接产品中文操作手册

In-Fusion®HDCloningKit操作手册PT5162-1(072012)Cat.Nos.ManyUnitedStates/Canada800.662.2566AsiaPacific+1.650.919.7300Europe+33.(0)1.3904.6880Japan+81.(0)77.543.6116ClontechLaboratories,Inc.ATakaraBioCompany1290TerraBellaAve.MountainView,CA94043TechnicalSupport(US)E-mail:[e-mail](Beijing)Co.,Ltd.VersionNo.072012ATakaraBioCompany2In-Fusion®HDCloningKitUserManual目录I.简介.......................................................................................................................................................................3II.组分列表...............................................................................................................................................................5III.需要的其他材料....................................................................................................................................................5IV.PCR和实验准备....................................................................................................................................................6V.您应该遵循哪一个操作流程?...............................................................................................................................9VI.操作流程I：In-Fusion克隆流程w/离心柱化......................................................................................................9VII.操作流程II：In-Fusion克隆流程w/CloningEnhancer处理..............................................................................10VIII.转化流程.............................................................................................................................................................11IX.预期结果.............................................................................................................................................................11X.疑惑解答指南.....................................................................................................................................................12XI.附录A：In-Fusion克隆快速操作流程...............................................................................................................14XII.附录B：pUC19LinearizedVectorInformation..................................................................................................15宝日医生物技术（北京）有限公司技术支持热线：8008106261电话：[phone]微博：邮箱：[e-mail]传真：[phone]网址：(Beijing)Co.,Ltd.VersionNo.072012ATakaraBioCompany3In-Fusion®HDCloningKitUserManualI.简介In-FusionHDCloningKits是一款简便高效的克隆试剂盒，能够将单个或者多个DNA片段快速定向克隆到任意载体中。In-Fusion克隆技术的基础是Clontech的In-Fusion专利酶，此酶通过识别DNA片段和线性化载体末端15bp同源序列将DNA片段和线性化载体高效精确地融合在一起。15bp同源序列是通过扩增目的片段所设计的引物来获得的。升级后的In-FusionHDKits的克隆效率高于之前的In-FusionKits，尤其表现在长片段、短核苷酸片段和多重片段克隆上。•克隆任意片段到您选择的任意载体中的任意位臵•可有效克隆的片段大小范围非常宽泛•通过单次反应将多重DNA片段克隆到任意载体中•无需进行限制性酶切处理、磷酸化处理或者连接反应•最终的重组载体不附加任何冗余或者不需要的碱基序列以下列表是In-FusionHDCloningKits操作流程总体概述。操作流程会在Figure1做进一步的说明。每一步操作细节请参考详细说明页面。TableI.In-FusionHD操作流程概要步骤操作页码1选择载体并识别插入位点。通过限制性酶切或者反向PCR获得线性化载体并纯化。62在目的基因PCR引物5'端设计一段与线性化载体末端相互补的15bp扩展序列。7-83采用高保真DNA扩增酶扩增目的基因。琼脂糖凝胶电泳验证扩增后的靶DNA，确定PCR产物的正确性。94采用离心柱纯化PCR产物或者采用CloningEnhancer进行处理。Spin-ColumnProtocolI(p.9)ORCloningEnhancerProtocolII(p.10)5建立In-Fusion反应体系:2μlof5XIn-FusionHDEnzymePremixXμlofLinearizedVectorXμlofInsertXμlofdH2O至总体积10μl。混合均匀。Spin-ColumnProtocolI(p.9)ORCloningEnhancerProtocolII(p.10)6将反应体系臵于50°C孵育15min，然后臵于冰上。Spin-ColumnProtocolI(p.9)ORCloningEnhancerProtocolII(p.10)7从步骤6取2.5μl反应液转化感受态细胞。11ProtocolNo.PT5162-1(Beijing)Co.,Ltd.VersionNo.072012ATakaraBioCompany4In-Fusion®HDCloningKitUserManualI.简介，续*如果获得的PCR产物具有非特异性背景，首先通过凝胶抽提分离靶基因片段，然后利用spin-column进行纯化。Figure1.In-FusionHD操作流程概要ProtocolNo.PT5162-1(Beijing)Co.,Ltd.VersionNo.072012ATakaraBioCompany5In-Fusion®HDCloningKitUserManualII.组分列表In-FusionHDCloningKits有10次，50次和100次规格可供使用。也可以购买附有Stellar™CompetentCells、NucleoSpinGelandPCRClean-Up、和/或者CloningEnhancer的试剂盒。所有组分储存于–20°C。In-FusionHDCloningKits组分Cat.Nos.639648639649639650Rxns.10rxns50rxns100rxns5XIn-FusionHDEnzymePremix20μl100μl200μlpUC19ControlVector,linearized(50ng/μl)5μl15μl30μl2kbControlInsert(40ng/μl)10μl30μl60μlIII.需要的其他材料本试剂盒不提供克隆实验所需要的以下材料：•Ampicillin(100mg/ml储存液)或者In-Fusion反应液铺板所需要的其它抗生素•LB(Luria-Bertani)培养基(pH7.0)•LB/antibiotic平板•SOC培养基•感受态细胞我们建议采用Stellar感受态细胞。如果您决定采用其他的商品化感受态细胞(比如DH10B、DH5α)，请确保其转化效率≥1.0x108cfu/μg。很多In-FusionHDCloningKits附有Stellar感受态细胞，您也可以单独购买不同规格的感受态细胞。•CloningEnhancer(Cat.Nos.639613,639614&639615)[可选]CloningEnhancer在部分In-FusionHDCloningKits中附带，也可以单独购买。CloningEnhancer用于移除模板DNA背景和PCR残留物，当PCR产物单一时（比如没有背景）无需在克隆前进行插入片段纯化操作。•离心柱——NucleoSpinGelandPCRClean-Up(Cat.Nos.740609.10,740609.50&740609.250)[可选]NucleoSpinGelandPCRClean-Up在部分In-FusionHDCloningKits中附带。如果琼脂糖凝胶电泳结果显示非特异性背景或者多重条带，可以采用离心柱纯化PCR产物。我们推荐NucleoSpinGelandPCRClean-Up离心柱。•CloneAmpHiFiPCRPremix(Cat.No.639298)CloneAmpHiFiPCRPremix是便捷的2X预混合酶试剂，由于CloneA