您好,欢迎访问三七文档
当前位置:首页 > 行业资料 > 其它行业文档 > PI染色法测细胞周期
PI染色法测细胞周期一)细胞DNA含量检测细胞固定后用PI(Propidiumiodide碘化丙啶),染色,因为PI特异性结合于细胞DNA,荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系,根据这个原理,可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。单参数直方图图中2N代表G0/G1期细胞,4N代表G2/M期细胞,两者中间代表S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图DNA细胞周期分析细胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量细胞数量2N4N2倍体异倍体4倍体肿瘤组织中的各种DNA倍体含量与凋亡关系DNA亚G1峰的检测:利用PI染色,检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例,代表凋亡细胞数。凋亡过程中,细胞内核酸酶的释放,将DNA降解,分解成小的片段,在标本制备中的固定处理时,细胞膜的完整性被破坏,使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出,造成总体DNA含量减少,成为亚2倍体。2.凋亡研究在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰,即凋亡峰。检测调亡,可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。AnnexinVAssayR1File:4AcquisitionDate:06-Mar-03QuadEvents%GatedXMeanYMeanUL2542.4037.47461.36UR106710.08816.86468.89LL529149.9819.574.41LR397537.55418.809.87图AnnexinV/PI双标记分析细胞凋亡和坏死Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48R1图FCM测试细胞周期分布和凋亡根据凋亡细胞的特点来检测在形态上,早期细胞核固缩,染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂;细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小;细胞膜皱折卷曲,但早期细胞膜的完整性未受到破坏凋亡细胞的FSC?SSC?细胞坏死时,细胞肿胀,FSC?,SSC?正常人静止体细胞有46条染色体,相当于7.10-12pgDNA/细胞核,我们称之为二倍体细胞,而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期(G0,G1,S,G2,M)的各个时期,DNA含量随各时相呈现出周期性的变化:在G1期,细胞开始RNA和蛋白质的合成,但DNA含量仍保持二倍体;进入S期后,DNA开始合成,这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间;当DNA复制结束成为4倍体时,细胞进入G2期,G2期细胞继续合成RNA及蛋白质,直到进入M期,因此,单纯从DNA含量无法区分G2期和M期;一旦有丝分裂发生,细胞分裂成两个子细胞,这两个子细胞或者进入下一个细胞周期,或者进入静止期(G0期),而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此,整个复制周期可以描述为G0/G1,S,G2/M期。通过核酸染料标记DNA,并由流式细胞仪进行分析,可以得到细胞各个时期的分布状态,计算出G0/G1,S及G2/M的百分含量,了解细胞的增殖能力;结合DNA指数分析,还可进行凋亡、异倍体等检测。G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle细胞浓度及质量要求单细胞和核的上机浓度应约106/ml。浓度太低,上机时样本的流速不得不提高,这样就会影响检测的CV。浓度太高,则可能导致染料的相对不足,最终使染色不饱和,同样影响CV和检测结果。制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量:细胞是否聚集或过多的碎片。染料的选择取决于流式激光的配置。488nm的激光下应用PI(碘化丙啶),由于PI也与RNA结合,所以分析前样本应用Rnase处理.。重要的是染料要足够,以保证饱和结合。PI的推荐浓度是至少20ug/106个细胞。其最佳浓度为50ug/106个细胞。操作步骤取一瓶生长期的A549细胞,倒掉瓶中旧的培养液,加入3mlPBS,细胞生长面在下轻轻晃动细胞瓶,然后去掉液体,加入1ml胰蛋白酶消化1~5分钟(以镜下观察决定)加入5mlPBS轻轻吹打细胞生长面,制成细胞悬液,将细胞悬液移至15ml离心管中1500rpm离心5min,去上清。加入500ulPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液,在旋涡状态下逐滴加入2ml-20℃95%冷乙醇,混匀后固定30min。加入5mlPBS,1500rpm离心5min,去上清液。加入5mlPBS重悬细胞,1500rpm离心5min,去上清液。加入800ulPI染液,用枪轻轻吹打细胞团,混匀,室温避光染色30min上机检测。影响荧光染色的因素温度:温度高于20℃时,即出现温度淬灭。2、PH:PI在7.2~7.6,保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡。3、荧光染料浓度:染料太少,结合不完全。染料过多,又会出现浓度淬灭现象。4、固定剂:醛类固定剂会干扰插入性染料与核酸分子的结合,造成荧光发射强度减弱。
本文标题:PI染色法测细胞周期
链接地址:https://www.777doc.com/doc-2702149 .html