余甘子根枝叶美白作用的探究实验报告20111018

余甘子根枝叶对酪氨酸酶活性的影响研究参加人：陈俊盛，冉正花，李朝丰复核：【摘要】目的：研究余甘子鲜果、干果以及余甘子根、枝、叶各部分提取物的美白效果。方法：以维生素C为对照，应用紫外分光光度法建立酪氨酸酶催化多巴转换成黑色素的体外模型，测定不同浓度余甘子鲜果、干果及余甘子根、枝、叶各部分提取物对酪氨酸酶活性的影响。结果：实验表明Vc、余甘子鲜果、干果以及余甘子根、枝、叶对络氨酸酶均有抑制作用，其EC50分别为0.12、5.84、9.27、16.31、14.99、12.44mg/ml；结论：余甘子鲜果、干果以及余甘子根、枝、叶均对酪氨酸酶活性有不同程度的抑制作用，且作用效果：余甘子鲜果余甘子干果余甘子根余甘子枝余甘子叶。【关键词】酪氨酸酶；余甘子；紫外分光光度法黑色素的形成是酪氨酸酶在机体内将L-酪氨酸羟化，产生邻位二羟基苯丙氨酸(L-多巴)，再将多巴氧化成多醌，进而生成一系列引起褐化的色素类物质[1]，最终导致人的皮肤变黑或是黄褐斑，雀斑。而植物美白一直是化妆品研究的一个重要方向，余甘子除了含有矿物质、微量元素、类胡萝卜素之外，还含有丰富的各类型果糖，八种自由氨基酸、消炎成分-鞣剂，以及丰富的维生素C等。本实验通过研究余甘子不同部位的乙醇提取物对酪氨酸酶的影响程度，来评价余甘子不同部位有无美白作用。1材料1.1仪器ThermoHeλios-r紫外—可见光分光光度计(赛默飞世尔科技（上海）有限公司，ThermoFisher)，电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司，BS110S），循环水式真空泵抽滤机（巩义市予华仪器有限公司，SHZ-D(Ⅲ)），飞鸽牌离心机（上海安亭科学仪器厂，AnheTDL-5-A），旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂，RE-52A），水浴锅（巩义市予华仪器有限公司，HH-S水浴锅）及实验室常用实验仪器。1.2试剂余甘子鲜果、余甘子干果、余甘子根、枝、叶（采自广东汕头雷岭镇，广东荔宝酿酒有限公司提供），乙醇（分析纯，天津市百世化工有限公司，批号：20100426），L-多巴（sigma），酪氨酸酶（sigma），磷酸二氢钠（分析纯，天津市百世化工有限公司，批号:20090920），氢氧化钠（分析纯，天津市福晨化学试剂厂，批号：20091012），磷酸二氢钾（分析纯，天津市大茂化学试剂厂批号:20090815）。2方法2.1样品的制备2.1.1余甘子鲜果溶液的制备取去核余甘子鲜果3g，用150ml的50%的乙醇回流2h，浓缩到80ml；精密量取5ml浓缩液至10ml容量瓶，定容至刻度，得2倍稀释液；精密量取2ml浓缩液至10ml容量瓶，定容至刻度，得5倍稀释液；精密量取浓缩液4ml浓缩液至25ml容量瓶，定容至刻度，得4/25倍稀释液；备用。2.1.2余甘子干果溶液的制备取去核余甘子干果2g，用150ml的50%的乙醇回流2h，浓缩到80ml；精密量取5ml浓缩液至10ml容量瓶，用50%的乙醇定容至刻度，得2倍稀释液；精密量取2倍稀释液，5ml浓缩液至10ml容量瓶，用50%的乙醇定容至刻度，得4倍稀释液；精密量取浓缩液1ml浓缩液至10ml容量瓶，用50%的乙醇定容至刻度，得10倍稀释液；备用。2.1.3余甘子根、枝、叶溶液的制备分别取余甘子根枝叶粉末5g，用35ml的50%乙醇回流1h，再加等量的50%乙醇回流1h,过滤，浓缩到40ml；用50%的乙醇稀释2倍，5倍，8倍，10倍，20倍，得到就不同浓度的样品溶液，备用2.1.4酪氨酸酶的提取去皮碎土豆60g(冷冻过夜),按2:1（W/V）加入PH=7.2的缓冲溶液30ml，捣碎制成匀浆，4000r/min下离心10min，取上层清夜置于冰箱中。取25ml酶提取液，用PH=7.2的缓冲稀释至100ml管中，摇均冷藏备用。2.1.5Vc样品的制备精密称量0.1027gVc样品，用少量的50%的乙醇溶解，移至10ml的容量瓶，定容至刻度，精密量取1ml上述溶液至10ml容量瓶，定容至刻度，得10倍稀释液，同样的方法制备50倍，100倍，1000倍稀释液，备用。2.2溶液配制2.2.10.10mol/L缓冲溶液（PH=7.2）制备精密量取25ml0．20mol／LNa2HPO4和10ml0．1mol／LHC1至100ml容量瓶，定容至刻度，备用。2.2.20.10mol/L缓冲溶液（PH=6.0）制备精密量取50ml0．20mol／LNa2HPO4和9ml0．1mol／LHC1至200ml容量瓶，定容至刻度，备用2.2.30.005mol／L多巴溶液制备准确称取0．0996g多巴，用蒸馏水溶解并定容至100ml容量瓶中。将配好的溶液置于黑暗处避光存放，冷藏备用。2.3样品对酪氨酸酶作用的测定方法[2]用安瓿瓶按下表1配制余甘子鲜果，干果稀释好的4种不同浓度溶液的待测浓度；配制余甘子根、枝、叶，维生素C稀释好的5种不同浓度溶液的待测溶液，置30℃水浴3min后，加入2ml酶液，再置30℃水浴，恒温25min后，在波长480nm处测定不同浓度的A值。表1测试液的配比表空白1测定A1空白2测定A2样品--11水312-PBS5555L-多巴-2-22.4标准曲线的绘制对酪氨酸酶活性的影响：以空白管调0，分别测定表1中A1、A2。若A1A2，则样品对酪氨酸酶活性有抑制作用，抑制率(I％)=(A1-A2)／A1×100%；若A1A2，则样品对酪氨酸酶活性有激活作用，激活率(E％)=(A2-A1)／Al×100%；A1：未加样品时所测得的吸光度值；A2：加入样品后所测得的吸光度值。计算个样品抑制率(或激活率）,以浓度对数-抑制率（激活率）做标准曲线，得回归方程并求得50%的抑制浓度（IC50）3结果3.1按“2.4”项下的公式计算抑制率，结果见表2表2各种样品对酪氨酸酶的抑制作用样品编号浓度mg/mllgC吸光度1吸光度2抑制率(%)线性范围(mg/ml)相关系数维生素C10.01-2.000.850.5832.080.01~10.780.9420.11-0.960.850.4744.9630.22-0.660.850.3559.0241.080.030.850.3262.53510.781.030.850.1285.95余甘子叶15.000.700.850.5831.735~500.97212.501.100.850.4646.72320.001.300.850.3164.17450.001.700.850.2076.81余甘子枝15.000.700.850.6128.225~500.94210.001.000.850.5040.98312.501.100.850.5041.92420.001.300.850.3163.23550.001.700.850.2471.78余甘子根15.000.700.850.6128.695~500.95210.001.000.850.5733.61312.501.100.850.5041.33420.001.300.850.3658.20550.001.700.850.2274.71鲜余甘子160.780.850.4448.656~37.50.9629.3750.970.850.3558.97318.751.270.850.2274.33437.51.570.850.1780.54干余甘子12.50.400.850.5535.522.5~250.9326.250.800.850.4844.20312.51.100.850.4349.364251.400.850.2965.773.2以抑制率做纵坐标，浓度对数为横坐标作图(如图1)，得回归方程及线性范围，并计算各样品的50%抑制浓度（IC50），结果如表3图1不同样品的不同浓度对酪氨酸酶作用的比较样品线性关系线性范围（mg/ml）IC50（mg/ml）维生素Cy=17.563x+65.8665~500.12余甘子叶y=46.698x-1.12965~5012.44余甘子枝y=46.326x-4.47255~5014.99余甘子根y=49.694x-10.2985~5016.31鲜余甘子y=40.809x+18.7216~37.55.8干余甘子y=28.656x+22.3452.5~259.20102030405060708090100(2.50)(2.00)(1.50)(1.00)(0.50)0.000.501.001.502.00鲜余甘子干余甘子余甘子叶余甘子枝余甘子根维生素C线性(鲜余甘子)线性(干余甘子)线性(干余甘子)线性(余甘子枝)线性(余甘子根)线性(维生素C)表3由以上数据可以表明，余甘子鲜果、余甘子干果、余甘子根、枝、叶提取物的实验结果均表现为A1A2,说明余甘子的不同部位对酪氨酸酶均有不同程度的抑制作用，都有良好的美白效果，余甘子根、枝、叶的效果显著；余甘子鲜果余甘子干果余甘子根余甘子枝余甘子叶。4讨论4.1酪氨酸酶在黑素产生的过程中饰演了重要的角色。酪氨酸酶活性增加，产生的黑素就会更多；活性被抑制，黑素细胞产生黑素的能力就相应降低。目前市场上美白药物主要是通过抑制酪氨酸酶活性，从而抑制黑素的形成，达到美白之功效。4.2实验结果证明，通过VC阳性对照证明余甘子不同部分对酪氨酸酶均有一定的抑制作用，也间接说明余甘子在美白化妆品领域有潜在的应用价值，但它的有效成分尚需进一步研究。4.3L-多巴见光易分解，需避光。4.4试剂要现配现用，试验的条件的选择应该充分考虑好PH的选侧（偏酸性）。4.5本实验是属于酶促反应，所以应该严格反应控制时间，加入酶后水浴25min立即测紫外。4.6本实验应采用水浴控制温度在30℃左右，试验结果发现在30℃酶有最大的催化活性，而且在30℃时试验的重现性最好。4.7酪氨酸酶的活性受金属离子的影响，因此要避免和减少金属离子的干扰。参考文献：[1]徐迪，马林，张凌等．酪氨酸酶催化氧化羟基吡啶类化合物的反应研究[J]．中山大学学报(自然科学版)，2002；41：33-5.[2]尤新．天然功能性添加剂一甘草甜和抗氧剂[J]．中国食品添加剂，2001，(5)：4—6．[3]刘宇红，董银卯，李才广．皮肤化学美白剂抑制酪氨酸酶活性的研究[J]．日用化学工业，2001；31：21—3[4]高秀蕊，宋秀芹，陈会兰．抗坏血酸对酪氨酸酶的抑制效应[J]．河北师范大学学报(自然科学版)，1990；1：36—40[5]王白强，曾晓军．酪氨酸酶活性抑制的研究及皮肤美白化妆品的研制[J]．福建轻纺，2002；158：1-6[6]杨顺楷，杨亚力，杨维力．余甘子资源植物的研究与开发进展[J]．应用与环境生物学报,20O8，l4(6):846=-85[7]刘晓丹，黄璜，陈清西．苯甲酸对蘑菇酪氨酸酶抑制作用机理的研究[J]．厦门大学学报(自然科学版)，2003；42：102-6.[8]陈虹,李庆英,朱鲲鹏.熟地、川芎提取物对酪氨酸酶活性的影响[J].武警医学院学报,2008,17(5):378-380.[9]蔡英卿，张新文．余甘子的生物学特性及其应用．三明师专学报，2000，(1)：72-74[10]陈丽凤，吴可克，王舫等．无机阳离子对酪氨酸酶活性的上调作用[J]．大连轻工业学院学报，2000，19(3)：176-177．[11]闫军，李昌生，陈声利等.14味中药对酪氨酸酶抑制作用的探讨[J].中国药房，2003,14（7）[12]宋杨，齐云，刘彬等.草桔梗皂苷对酪氨酸酶抑制的合并效应研究[J].中国实验方剂学杂志2007,13(3)[13]沈钧，何莉萍，张瑞斌.甘草提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用[J].中国临床药理学与治疗学,2006,11(8):940-942[14]马晶波,黄岚，马淑芳等.旱金莲提取祛斑作用的实验研究[J].上海中医药杂志，2003,37（5）[15]雷波.金花葵总黄酮抑制酪氨酸酶活性的研究[J].宜春学院学报,2009,31(4)[16]李张伟，马竖斌，曾绮杨.余甘子黄酮的提取及其抗氧化作用研究[J].江苏农业科学,2010(2)