作用于多靶标的大环内酯衍生物的设计与活性研究

作用于多靶标的大环内酯衍生物的设计与活性研究陈红燕、程刚英，区加怡，陈秀琴、姜凤超*华中科技大学同济医学院药学院武汉430030摘要：目的：设计合成多靶点大环内酯类衍生物，以扩展抗菌谱、增加抗菌活性、减少细菌耐药性、降低副作用。方法：根据大环内酯类和四环素类抗生素具有抗菌谱互补性，以及作用位点相似性的特点，针对大环内酯与四环素的不足，利用拼合原理设计合成多靶点大环内酯类衍生物。结果：以阿奇霉素和红霉素为起始母环，利用拼合原理，设计并合成了两个多靶点作用药物，利用Mannich反应合成了四环素C-2结构修饰物，为四环素和大环内酯的结构改造提供基础。体外抗菌活性测试显示，合成的化合物A有较好的抗耐药菌活性，对耐药肺炎链球菌8220和耐药金黄色葡萄球菌8195抗菌活性都高于红霉素和阿奇霉素。结论：本实验利用拼合原理设计并合成出两个多靶点抗菌药物，对其结构进行了确证。并对其进行了抗菌活性试验，验证多靶点作用药物在抗菌药物设计中的可行性。提出并利用微波辐射方法合成了红霉胺以及利用微波辅助催化大环内酯类的Mannich反应，使反应时间大为缩短，产率得到显著提高。关键词：大环内酯；阿奇霉素；四环素；结构改造；多靶点；Mannich反应；微波辐射；拼合原理DesignandActivityStudiesofMulti-TargetMacrolideDerivativesAbstract：Object:Designandsynthesizemulti-targetantibiotics,whichhavebroadspectrum,enhancedantibioticproperties,reducedbacteriadrugresistanceandsideeffects.Method:Accordingtothedisadvantagesofmacrolidesandtetracyclines,multi-targetantibioticsweredesignedandsynthesizedbyconnectingtogetherthetwoantiboticesbasedonthecomplementarityintermsofantibacteriaspectrumandthesimilarityontheactionsitesofmacrolidesandtetracyclines.Result:Twomulti-targetcompoundsweredesignedandsynthesizedbasedonazithromycinanderythromycylaminebycombinationprinciple.MannichreactionswerecarriedouttoproducetetracyclineC-2derivatives.Thispaperprovidedfoundationforthefurthertetracyclinesandmacrolidesstructuremodification.ActivitytestsinvitroshowedthatcompoundAhasbetterantibacterialactivitytomacrolide-resistantS.pneumoniae8220,andS.aureus8195thanerythromycinandazithromycin.Conclusions:Twonewmulti-targetmacrolidederivativesweredesignedandsynthesized.Theirstructurewereconfirmed.Theirantibacterialactivitieswerealsotestedtoconfirmtheidealofmulti-targetantibioticsindrugdesign.Proposedandsynthesizederythromycylaminebyusingmicrowaveirradiationmethodandmicrowave-assistedMannichactionofmacrolidessoastoshortenthereactiontimegreatlyandenhancetheproductionrateremarkably.红霉素系等大环内酯类抗生素自1952年进入临床应用以来已经进入到第三代，以阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素等为主第二代红霉素衍生物,抗菌谱和抗菌活性均与红霉素基本类似,由于对酸稳定,具有良好的药代动力学性质,从而增强了疗效,对呼吸系统感染疗效明确。但是第二代红霉素衍生物仍存在着局限性:①抗菌谱与过去的大环内酯类抗生素基本相同,适应证亦无差异。②尚未出现抗菌活性明显高于红霉素A的品种，只有阿奇霉素抗流感杆菌和克拉霉素抗军团菌活性有所改进。③细菌耐药性与过去的大环内酯类抗生素无明显差别,红霉素衍生物仍具有诱导耐药性。可见,改善耐药性、扩展抗菌谱、增加抗菌活性依然是大环内酯类抗生素研究的主攻方向。导致耐药性产生的与酸性条件下大环内酯的脱水，体内酶的作用等因素有关[1]，四环素类药物Tcs(tetracyclines)是由放线菌产生或再经半合成制得的一类广谱抗生素，早在本世纪50年代四环素就开始用于临床。它们抗菌谱极广，除对革兰氏阳性菌和阴性菌有作用外，对立克次体、衣原体、支原体、螺旋体亦有抑制作用。由于四环素类抗生素低价格、低毒性，口服给药导致了它们被紊乱大量使用，因此产生了对四环素类耐药的细菌，严重影响了四环素的临床应用。四环素作用机制主要是以共价键的形式与细菌核糖体的30S亚单位以尿嘧啶核苷酸方式结合，阻止氨基酰tRNA到达并与核糖体复合物A位结合，从而阻止肽链延伸，抑制核糖体的翻译。四环素的耐药性是一个比较严重的问题，细菌产生耐药基因，编码核糖体保护蛋白，恢复细菌的蛋白质合成，或是细菌中的外排泵蛋白将四环素主动排出是四环素的主要耐药机制。近年来，随着对四环素药理作用认识的深入，发现四环素除了抗菌作用外还具有多种非抗生素特性(如抗炎、免疫抑制、清除机体氧自由基等)，使其临床用途得到不断扩大，在抗炎、抗肿瘤、类风湿性关节炎、骨关节炎、血管增生等方面亦具有巨大的潜力[5]。综上所述，根据大环内酯类衍生物的发展状况以及存在的问题，有必要从扩展抗菌谱、增强抗菌活性、克服耐药性、改善药物动力学性能（如增强稳定性、提高血药浓度、延长消除半衰期）等方面出发，借用多靶点配体药物的理念，对大环内酯类抗生素进行适当的结构修饰，设计更多高效、低毒、适用性强的新型大环内酯类衍生物。考虑到大环内酯类和四环素类抗菌药物的抗菌谱之间的互补性，大环内酯类主要对革兰氏阳性菌作用较强，四环素类主要作用于革兰氏阴性菌，用化学方法将两种药物连接起来制成孪药有可能发挥两者的抗菌作用。另一方面，大环内酯类和四环素类抗生素分别作用于核糖体的50S亚单位和30S亚单位，这两类药物由于作用于核糖体的不同部位，利用拼合原理连接两个药物可以得到多靶点配体药物(双重作用药物)，有利于增加抗菌活性、减轻细菌耐药性、降低副作用。为验证设计思路的合理性，利用两倍稀释法测试目标化合物的抗菌活性。在菌株选择方面，针对设计目的，既选取了对大环内酯类药物抗菌活性进行质量控制的金葡菌ATCC25923，肺炎链球菌ATCC49619，大肠杆菌ATCC25922，绿脓杆菌PA01作为试验菌株，又选取了从临床分离的大环内酯类药物的相关耐药菌株金葡菌8195和肺炎链球菌8220作为试验菌株进行实验。1.1目标化合物设计本文选择红霉素、阿奇霉素以及四环素作为原料分别进行结构改造，期望在保持以往优良性质的同时，对大环内酯进一步进行结构改造。四环素的结构改造主要发生在C-6、C-7、C-9位，这几种改造方式都比较复杂，参与的反应包括重氮化反应、取代反应、桑德迈尔反应等，并且反应产率低，后处理复杂[16]。通过文献的查阅发现C-2位酰胺基的胺基可以与甲醛以及另外一个伯胺发生曼尼西反应(Mannichreaction)，可以很方便的在C-2位酰胺基的胺上引入取代基。而且该反应后处理简单，产率较高。Alen[17]等研究证明大环内酯C-3位克拉定糖是诱导细菌产生耐药性的关键基团，C-3水解脱糖或对克拉定糖进行化学修饰是改善药物耐药性的可行途径。在对克拉霉素的结构改造中发现用对硝基苯乙酰基替换克拉定糖得到的化合物的活性是克拉霉素16倍[18]，本文尝试将15元氮杂内酯阿奇霉素的3位克拉定糖用四环素基团替换以期望得到较好抗菌活性的化合物。据文献报道在1mol/L盐酸溶液中3位克拉定糖可以温和完全的脱去，而对抗菌活性必需的5位脱氧氨基糖和大环内酯结构没有影响。由于大环内酯化学结构中羟基较多，在3位羟基与四环素反应之前，要先保护反应活性较强的羟基。在大环内酯结构中11-，2′-，4''-位的羟基是仲羟基，而6-和12-位的羟基是叔羟基，反应活性要比仲羟基差，因此羟基活性大小顺序是2′-，4''-，11-，6-，12-位。在酰化反应中，2′位羟基的活性也大于脱去克拉定糖后的3位羟基。因此，在3位羟基与四环素缩合之前，应该将2′-OH保护起来，而将2′-OH乙酰化即可达到目的。2′-O-乙酰基对化合物的活性没有影响。目标化合物合成线路设计根据目标化合物的设计，考虑到大环内酯和四环素的具体理化性质，对于目标化合物的具体合成路线进行了设计。1.阿奇霉素先水解脱掉C-3位克拉定糖，再将2′位羟基保护，接着利用曼尼西反应与四环素连接成多靶点药物。2.利用微波辐射合成方法改造红霉素C-9位羰基，使其变为红霉胺，再利用曼尼西反应与四环素缩合成目标化合物。合成线路见下图。OHOHOOOOOHOHONOOHOOHOHOOOHOOHOHONH+Ac2OOHOHOOOHOOHOAcONNNNTcA1A2AMWOHOHOOOOHOHONNNHOOHNHOOOOOHOHOH图2-1目标化合物A的合成OHOOHOOHOOOOHONOOHOOHOOHOH2NHOOOOONOOHOOHCOOH,RNH2MWTcOHOOHONHHOOOOHONOOHOOOOHOHOHOHHONNHOB1BMW三.实验部分3.13-羟亚甲基-(N2-四环素)-阿奇霉素(A)的合成3.1.13-羟基阿奇霉素(A1)的合成将阿奇霉素(19.6g,26.20mmol)溶于100mL的盐酸水溶液(1mol·L-1)中，室温搅拌下反应5小时。在冰浴冷却下，向反应液中滴加氨水调至溶液pH值约等于9，有大量白色固体析出，加入CH2Cl2萃取(30mL×3)，合并有机相，并用饱和NaHCO3和H2O分别洗涤有机相两次，无水MgSO4干燥，减压蒸除CH2Cl2溶剂，真空干燥，得白色固体(A1)13.6g，产率87.98%，mp111~113℃。TLC:Rf=0.66(流动相：乙酸乙酯:丙酮:氨水＝2:1:0.5，阿奇霉素Rf=0.84)。UVλmax/nm(CH3OH):221;IRσ/cm-1:3467(νOH),2973(νasCH3),2938(νasCH2),2876(νsCH3),1714(νC=O)3.1.22′-O-乙酰基-3-羟基-阿奇霉素(A2)的合成将3-羟基阿奇霉素(A1)(13.6g,23.05mmol)溶于70mLCH2Cl2中，搅拌条件下滴加乙酸酐(5.6mL,46.13mmol)和三乙胺(3.3mL,23.05mmol)，滴加完毕室温搅拌反应10小时。反应完成后加入饱和NaHCO3溶液(100mL×3)洗涤有机相，最后有机相用100mLH2O洗涤一次，有机相无水MgSO4干燥，减压蒸除CH2Cl2溶剂，真空干燥，得白色固体(A2)12.7g，产率87.18%，mp118~121℃。TLC:Rf=0.70(3-羟基阿奇霉素Rf=0.66)。UVλmax/nm(CH3OH):221。IRσ/cm-1:3491(νOH),2973(νasCH3),2940(νasCH2)