人肝素结合性表皮细胞的构建与鉴定

合肥师范学院本科毕业论文（设计）开题报告（学生填写）学号1211451054姓名黄思玉指导教师陈金武题目人肝素结合性表皮生长因子原核表达质粒的构建与鉴定课题内容：一、选题依据1、本课题的目的及意义作为表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)家族成员之一的肝素结合性表皮生长因子(heparin-bindingepidermalgrowthfactor-likegrowthfactor,HB-EGF)可参与囊胚的着床,骨骼肌的发育，心肌的分化,肾小管的形成,伤口处或缺血/再灌注损伤后的组织修复和肿瘤的形成[1]。本实验通过构建人肝素结合性表皮生长因子高效重组载体，将重组表达质粒转化进入大肠杆菌中，经TPTG诱导后目的基因表达产生大量高纯度的人肝素表皮结合性生长因子。所以研究人肝素结合性表皮生长因子对于心肌的分化，肾小管的形成，以及骨骼肌的发育等方面都有重要的作用，我们从细胞中提取目的基因入手，接着对目的基因进行扩增，并构建重组质粒，导入到大肠杆菌中进行检测与表达。从而得到更好的表达质粒，使其可以表达出纯度更高的人肝素结合性表皮生长因子，这对于医学研究和科学研究都有重要的意义。2、国内外的发展状况肝素结合样表皮生长因子(Heparin-bindingepidermalgrowthfactor-likegrowthfactor，HB-EGF)是1988年Bester等在人巨噬细胞培养液中发现的。可由巨噬细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞等分泌产生[2]。在人类和动物的多种组织中均有分布，如皮肤、肺、骨骼肌和中枢神经系统，具有广泛的生物学作用[3]。它是分子量为20-22KD的单链蛋白质，其基因位于人类第五号染色体上，是近年来发现的表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)家族中的成员之一，其生物活性与EGF类似，但促细胞分裂活性较EGF强，因其与肝素有较强亲和性而得名[4]，与EGF家族中其它因子一样，都是主要通过与EGF受体结合后发挥生物学作用。HB-EGF前体为跨膜蛋白分子(proHB-EGF)，降解后产生游离HB-EGF(sHB-EGF)，proHB-EGF可促进邻近细胞的增殖并抑制其凋亡[5]。sHB-EGF是许多细胞的有丝分裂原，包括角质形成细胞、平滑肌细胞、上皮细胞等。近年来研究发现HB-EGF与生殖内分泌有极其密切的关系，在子宫内膜、早孕绒毛及蜕膜组织中有表达[6]，可促进子宫内膜生长、分化，在介导胚泡的黏附与着床、维持胎盘的功能方面起着非常重要的作用。目前有许多研究已经证明HB-EGF参与骨骼肌发育、心肌分化、肾小管形成、伤口处或缺血再灌注损伤后的组织修复以及多种肿瘤的形成[7]。有日本学者发现[8]上皮性卵巢癌患者腹水上清中HB-EGF浓度明显高于良性卵巢瘤组及正常卵巢组，说明其与卵巢癌发生发展有关。伴随产生的羧基末端，即HB-EGF-C，从胞浆质膜转移至胞核，与transcriptional抑制物前髓细胞性白血病锌指(PLZF)结合[9]。HB-EGF-C的结合引起胞核PLZF输出，允许细胞周期蛋白A(CyclinA)表达，通过加速通过S期引起细胞周期进展。ChristopherKramer等[10]在对膀胱癌临床标本的研究中发现癌细胞核内HB-EGF信号表达增多预示着不良预后[11]。HB-EGF还可通过G蛋白耦联受体配体在EGFR转活过程中起关键作用[12]，这些受体包括透明质酸，内皮素-1和血管紧张素-Ⅱ等。二、研究目标和内容1、研究目标本实验的研究对象为人肝素结合性表皮生长因子，我们从细胞中提取目的基因入手，接着对目的基因进行扩增，并构建重组质粒，导入到大肠杆菌中进行检测与表达，从而得到更好的表达质粒，使其可以表达出纯度更高的人肝素结合性表皮生长因子。2、研究内容（1）通过从细胞中提取出mRNA逆转录出cDNA。（2）引物与cDNA结合，并通过PCR进行扩增。（3）得到扩增后的目的基因，通过T4连接酶与表达质粒连接。（4）然后导入到大肠杆菌中进行双酶切检测，观察其是否可以表达。三、课题关键问题及难点：1、关键问题（1）通过查找文献找出培养载有人肝素结合性表皮生长因子的细胞和最适条件。（2）mRNA的制备，cDNA第一链的合成，cDNA第二链的合成，cDNA与接头连接及载体连接，质粒的转化。（3）PCR扩增要具有特异性，高效性和忠实性。（4）进行连接反应时通过设置不同梯度的保温时间和温度使连接条件最优化。（5）酶切鉴定时关键要控制好影响限制性内切酶活性的因素。2、难点（1）mRNA纯度和完整性对于cDNA的构建至关重要，所以要保证mRNA的纯度以及完整性。（2）引物的设计对于cDNA的扩增至关重要，所以引物的选择以及浓度非常重要。（3）双酶切的过程中要注意温度和时间的控制。（4）重组子的转化过程中，为了能使长出的菌落分布良好，涂布时应该均匀。（5）酶切的鉴定所用的限制性内切酶极易失活，因此酶切时应尽量注意将影响酶切的因素降到最低。四、拟采取的方式、方法及实施方案（主要技术路线）1、拟采取的研究方案1.1培养细胞：对含有目的基因的细胞的培养，通过查找相关资料，找到合适培养条件以及方式对其进行培养。1.2获得目的基因：1.2.1总RNA提取试剂盒：将带有人肝素结合性表皮生长因子组织用液氮研磨，转移到离心管中，加入Trizol试剂，氯仿/异戊醇等进行离心分离得到其RNA样品。1.2.2反转录PCR：首先合成cDNA第一链，然后通过设计合适的上下游引物，加上His标签，然后按照次序加入PCR所需要的其他试剂对目的基因进行扩增，以获得大量的目的基因（ITGBL1）。1.3质粒的构建：1.3.1HindⅢ和SalI对pET19B质粒DNA的双酶切：在无菌Ep管中加入无菌水，HindⅢ酶切缓冲液，pET19B质粒DNA，HindⅢ限制性内切酶进行离心，水浴，然后加入Nacl和SalI限制性内切酶再进行离心和水浴。电泳分析鉴定DNA酶解效果。1.3.2DNA片段的体外连接：将回收的DNA片段和质粒片段实现定向连接,在无菌Ep管中依次加入重蒸水、缓冲液、双酶切处理的质粒DNA片段、双酶切外源DNA片段、T4DNA连接酶，先离心然后水浴进行连接，连接后要做电泳对照观察连接效果。1.3.3肠杆菌感受态细胞的制备和重组子的转化：用CaCl2法制备感受态细胞，将体外重组质粒DNA引入受体细胞，可用蓝白斑筛选的方法进行涂布，观察平板长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。1.3.4菌落PCR筛选阳性重组子：在高温条件下，破裂的细菌细胞内裸露DNA变性变成单链状态的DNA，以此单链DNA作为模板用于PCR,检测该DNA是否含有重组的外源DNA序列。1.4重组质粒的酶切鉴定和测序：对于初步筛选具有重组子的菌落，提取重组质粒，用相应的限制性内切酶切割重组子释放插入片段，对于可能存在的双向插入的重组子用适当的限制性内切酶鉴定插入方向，然后用琼脂糖凝胶电泳检测插入片段和载体的大小，进一步坚定初筛结果。此外，还可将重组质粒进行测序鉴定。1.5外源基因在大肠杆菌中的诱导表达：目前常用的大肠杆菌表达质粒有pGEX和pET系列，本实验可选择采用pET系列，首先挑选经筛选鉴定的阳性重组子和含有空载体的大肠杆菌BL-21(DE3)菌落分别接种于装有合适氨苄青霉素的液体LB培养基的试管中用于重组菌的扩增，然后用IPTG对重组菌外源基因进行诱导表达，最后收集菌体细胞进行蛋白样品的抽提。2、技术路线含有目的基因的菌株的培养总RNA的提取反转录PCR对质粒DNA进行双酶切DNA片段的体外连接大肠杆菌感受态细胞的制备和重组子的转化菌落PCR筛选阳性重组子重组质粒的酶切鉴定和测序外源基因在大肠杆菌中的诱导表达五、进度安排第一阶段：2015年11月确定论文题目。第二阶段：2015年11-12月查询、收集相关资料并初步设计实验方案。第三阶段：2016年1月从含有目的基因的细胞中提取RNA。第三阶段：2016年2-3月把RNA转化为cDNA同时进行PCR扩增，制备质粒载体。第四阶段：2016年3-4月把目的基因导入质粒中，转入到大肠杆菌中进行检测与表达。第五阶段：2016年5月在老师论文审阅后，对论文进行完善，最终定稿，准备论文答辩。参考文献：[1]IzumiY，HirataM，HasuwaH，etal．Ametalloprotease－disinte-grin,ADAM9/MDC9/meltring，andPKC－dareinvolvedinTPA－inducedectodomainsheddingofmembrane－anchoredheparin－bindingEGF－likegrowthfactor［J］．EMBOJ，1998，17:7260－7272[2]HigashiyamaS，AbrahamJA，MillerJC，etal．Aheparin－bindinggrowthfactorsecretedbymacrophage－likecellsthatisrelatedtoEGF［J］．Science，1991，251:936－939．[3]MiyamotoS，YagiH，YotsumotoF，etal．Heparin－bindingepider-malgrowthfactor－likegrowthfactorasanoveltargetingmoleculeforcancertherapy［J］．CancerSci，2006，97(5):341－347．[4]ShimuraT,YoshidaM,etal,NucleartranslocationofthecytoplasmicdomainofHB-EGFinducesgastriccancerinvasion.[J]BMCCancer.2012May30;12:205-208.[5]LinJQ,HutchinsonL,GastonSM,etal.BAG-1isanovelcytoplasmicbindingpartnerofthemembraneformofheparin-bindingEGF-likegrowthfactor［J］.JBiolChem,2001,276:30127-32.[6]AsakuraM,KitakazeM,TakashimaS,etal.CardiachypertrophyisinhibitedbyantagonismofADAM12processingofHB-EGF:metalloproteinaseinhibitorsasanewtherapy[J].NatureMed,2002,8:35-40.[7]LeeKS,ParkJH,LeeS,etal.HB-EGFinducesdelayedSTAT3activationviaNF-kappaBmediatedIL-6secretioninvascularsmoothmusclecell[J].BiochimBiophysActa,2007,1773:1637-44.[8]ZhangH,SunnarborgSW,FaberJE.Heparin-BindingEGF-LikeGrowthFactor(HB-EGF)mediateslowflow-inducednegativehypertrophicremodeling(FINR)butnothighflow-inducedpositiveeutrophicremodeling(FIPR)ofcarotidartery[J].Circulation,2006,114:217-223[9]张斌,王鲁梅,侯智勇,胡建铭.卵巢癌中C-erbB2和CD44v5的表达及临床意义[J].中国现代医学杂志,2007,17(1):32-35.[10]李玲玲.低分子肝素对胎儿生长受限患者胎盘超微结构及血管内皮生长因子表达的影响［J］.中国妇产科临床杂志，2013，13(6):440－442．[11]FujinoT,HasebeN,FujitaM,