优化的前处理方法可以提高NSCLC患者的ctDNA的KRAS突变检出率

优化的前处理方法可以提高NSCLC患者的ctDNA的KRAS突变检出率介绍利用ctDNA进行非侵入性的突变检测具有很大的应用前景。这可以为无法获得组织标本的患者提供更多的治疗选择。材料和方法我们分析了45例NSCLC患者的血液和组织的匹配情况。我们研究了DNA提取相关因素对KRAS突变检测的影响：样本收集管，孵育时间，离心步骤，血浆提取量和DNA提取试剂盒。结果2小时的孵育时间，两次血浆离心分离（2000xg）可以降低总DNA的污染。同72小时后采用EDTA抗凝管收集的全血相比，cfDNA专用采血管收集的全血污染概率更低、KRAS突变检出率更高。血浆收集量和不同类型的DNA提取试剂盒均可影响DNA的提取量。结论本研究显示较好的前处理步骤可以获得高质量的用于NSCLC患者突变检测的ctDNA。开发标准的用于KRAS突变检测的标本ctDNA提取方法可以降低前处理步骤对突变检出率的影响。利用cfDNA专用采血管进行快速的标本处理是有益的。结果不同的血浆处理步骤提取的DNA质量为了验证是否存在不同的血浆处理方法会导致不同的gDNA污染水平，我们收集了20例NSCLC患者的血浆，并按照不同的方法进行处理（图1A和图2）。采用EDTA抗凝管和较长的孵育时间可以显著提高DNA的提取量（p0.01），平均值±SD：EDTA抗凝管2h孵育（2.46±1.60ng/μL）对比EDTA抗凝管72h孵育（15.12±16.44ng/μL）（图2A）。采用cfDNA专用采血管72h孵育提取出的DNA量（3.31±1.82ng/μL）比cfDNA专用采血管2h孵育提取出的DNA量（2.39±1.42ng/μL）具有显著性的提高（p0.01）（图2B）。当血浆处理时间超过2h时，采用任意一种采血管提取出的总DNA并没有显著性差异（2C）。采用cfDNA专用采血管血浆孵育72h提取出的DNA量远低于采用EDTA采血管同等处理条件下提取出的DNA量（p0.01）（图2D）。进一步分析每个亚组单次离心和两次离心对患者标本DNA提取量的影响（图2E和图2F）。血浆2h两次离心提取出的DNA量并没有比血浆1h单次离心提取出的DNA量有显著性的提高（图2E）。但是，当样本放置72h后，双次离心（19.35±24.3ng/μL）较单次离心（35.47±32.1ng/μL）相降低了提取DNA的平均量。5个样本中的4个样本提取出的DNA有所降低，但这种差异并不显著（P=0.058）（图2F）。总体分析，这些结果表明优化的血浆处理步骤可以影响DNA的提取水平。图2.血浆处理方法对比。收集20例NSCLC患者的全血，用不同的采血管、孵育时间和离心次数进行处理。将其中一个亚组患者（N=5）全血的单次离心和两次离心步骤的进行对比。用ABI的TaqMan探针检测提取DNA的量。A：EDTA采血管收集的全血，孵育2h或者72h。B：cfDNA专用采血管收集的全血，孵育2h或者72h。C：EDTA采血管或cfDNA专用采血管收集的全血，孵育2h。D：EDTA采血管或cfDNA专用采血管收集的全血，孵育72h。E：EDTA采血管收集的血液孵育2h，单次或双次离心进行处理。F：EDTA采血管收集的血液孵育72h，单次或双次离心进行处理。每例患者的处理结果均列在图中。采用t检验进行统计分析；**p0.01。不同血浆处理步骤的KRAS突变检测不同的血浆处理步骤也被用于研究20例患者的KRAS突变检测（图1A）。从任何血浆前处理步骤中获取的DNA均用于KRAS突变检测，并同凯杰的therascreenKRAS突变检测试剂盒检出的FFPE组织标本阳性的患者进行对比（n=10/20；数据未显示）。在该队列研究中，cfDNA专用采血管血浆孵育2h的标本KRAS突变一致率为50%（n=5）而同等条件下血浆孵育72h的阳性一致率为40%（n=4）。然而，同非最优处理方法相比，突变的阳性检出率有所下降。同一患者标本，EDTA采血管血浆孵育2h处理后的标本阳性检出率为40%（n=4），同等条件下血浆孵育72h处理后的标本阳性检出率为20%（n=2）（表1）。10例血浆标本的CT值、KRASDNA总扩增数（KRAS控制组）和ΔCT值见表S1。根据凯杰的therascreenKRAS突变检测试剂盒说明书判定KRAS突变状态，突变标本的ΔCT值临界值为6.6-8。由于携带有KRAS突变的ctDNA可检测的标本数量较少，无法进行显著性分析。表1.NSCLC患者的血浆KRAS突变检测总的可扩增的KRASDNA（KRAS控制组）在所有DNA标本中具有相似的趋势（图2）（表S1）。非最优条件下提取出的DNA的CT值较低，这表明此条件下提取出的DNA受到了较大的污染；平均CT±SD分别为：EDTA采血管孵育2h（29.0±1.0），EDTA采血管孵育72h（25.5±1.5），cfDNA专用采血管孵育2h（29.4±1.1），cfDNA专用采血管孵育72h（28.5±1.0）（表S1）。这些结果表明，血浆处理步骤中所采用的方法均可影响KRAS突变检测和总的KRASDNA扩增。不同血浆量提取出的DNA质量正如预期的一样，随着血浆样本量的增加，从15例患者标本中提取出的DNA也逐渐增加（图3）（P0.01）。提取DNA总量的增加可以提高DNA的浓度，可用于检测突变状态的ctDNA的拷贝数也会增加。从3mL血浆中提取出的DNA的平均量为4.39±4.55ng/μL，其他的为3.03±3.24ng/μL（2mL血浆）和1.79±1.81ng/μL（1mL血浆）。本队列研究中的15例患者中，7例患者的血浆KRAS突变和组织的检测结果相匹配；1例患者（23号）的血浆样本中检测出了KRAS突变，但该患者的其他三个标本的ΔCT值均在临界值以外（表S2）。这可能是由于这个特别的血浆标本是放于普通的EDTA采血管中，在非最优处理方法下，采用单次离心提高了检出率。有趣的是，KRAS突变控制组在qPCR反应中也显示了一个相似伴随DNA量的变化趋势（图2）。随着血浆样本的增加，KRAS控制组也出现了一个较低的CT值。同2mL血浆(27.1±1.8)和1mL血浆(28.1±1.7)相比，3mL血浆组(26.5±1.7)的KRAS内控值（平均CT值±SD）具有一个显著性的提高（p0.001）（表S2）。这些数据表明不同的血浆提取量可以影响DNA的总提取量和KRAS的总扩增数。然而，对于KRAS突变检测，仍然需要对大量的可检测样本进行分析。图3.血浆提取量对比。处理本队列研究中来自15例NSCLC患者的三种体积的血浆（1mL，2mL，3mL）。用QIAamp试剂盒提取DNA，并利用ABITaqMan突变检测试剂盒进行qPCR检测。列出了每例患者的检测结果。采用t检验进行统计分析；**p0.01。DNA提取试剂盒的对比采用三种不同的方法对10例患者平均每例2mL的血浆进行提取DNA。这三种方法均可成功的提取出DNA（图4），其中凯杰的QIAamp核酸提取试剂盒提取的DNA量最高，平均值±SD（3.03±2.19ng/μL）；AnalyticJena’sPME提取试剂盒提取的DNA量为(0.83±0.88ng/uL;p0.001)；凯杰DSPVirus/Pathogen提取试剂盒提取的DNA量为(0.53±0.53ng/μL;p0.01)。手动提取试剂盒快速简单实用于小标本的DNA抽提，而DSPVirus/Pathogen提取试剂盒的使用需要进行特殊的训练，但该试剂盒更适用于高通量、连续性操作。图4.DNA提取试剂盒的对比。采用三种不同的DNA提取方法抽提从10例NSCLC患者体内收集的2mL血浆：凯杰的QIAampDNA提取试剂盒；AnalytikJena的PMEDNA提取试剂盒；凯杰的DSPVirus/PathogenDNA提取试剂盒。采用ABITaqMan试剂盒检测DNA。该图列出了每例患者的检测结果。采用t检验进行统计分析；**p0.01。参考文献JamesL.Sherwood,ClaireCorcoran,HelenBrown.OptimisedPre-AnalyticalMethodsImproveKRASMutationDetectioninCirculatingTumourDNA(ctDNA)fromPatientswithNon-SmallCellLungCancer(NSCLC).PLOSONE;2016,2,26,1-14