细胞凋亡、自噬、坏死

一、细胞凋亡、自噬、坏死概念细胞死亡是指细胞因受严重损伤而累及胞核时，呈现代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，其一般分为程序性细胞死亡和非程序细胞死亡，细胞凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)属于前者，细胞坏死(necrosis)属于后者。细胞凋亡是一个主动的通过调控一系列基因的活化和表达等使细胞自动结束生命的过程。从形态学上看，首先细胞变圆，随即与周围细胞脱离；细胞失去微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质密度增高，凝聚在核膜周边；然后核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体聚集在一起，被反折的细胞膜包围。从外观上看，细胞表面产生了许多泡状或芽状突起；接着这些突起逐渐分隔，形成单个的凋亡小体(apoptoticbody)；最后凋亡小体被邻近的正常细胞吞噬并消化。细胞自噬，是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。自噬，即自体吞噬，是一种存在于正常细胞和病态细胞中的非选择性降解机制，是细胞内长寿蛋白降解的主要途径。它的主要作用是在应激状态下一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体（动物）或液泡（酵母和植物）中，为细胞生长代谢提供必要的大分子物质和能量，并清除细胞内过剩或有缺陷的细胞器。细胞坏死是一个被动的因极端的物理化学因素或严重的病理性刺激引起的细胞损伤和死亡。细胞坏死的结局与细胞凋亡类似，坏死过程中细胞膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，染色质随机降解，早期核无明显形态学变化，最后细胞破裂；另外坏死的细胞膜发生渗漏，导致细胞内容物释放到胞外，从而引起炎症反应；在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化，形成瘢痕。而未得到及时清除的凋亡细胞也会发生胞膜破裂溶解、胞浆外泄并引发炎症反应的现象，即发生继发性坏死，这在体外培养细胞及巨噬细胞发生功能障碍的机体中较为常见。近期有研究表明，细胞坏死可能是细胞“程序性死亡”的另一种形式，具有包括引发炎症反应在内的重要生理功能。当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时，坏死作为凋亡的“替补”方式被采用。二、区别细胞凋亡细胞自噬细胞坏死诱因生理条件下的基因调控营养缺乏或激素诱导极端的物理化学因素或严重的病理性刺激细胞形态细胞缩小细胞产生空泡细胞膨大、变形细胞膜起泡形成凋亡小体，磷脂酰丝氨酸外翻，膜结构完整膜结构完整膜结构遭破坏细胞器完整被双层膜结构的自噬泡包裹，最终被溶酶体或液泡消化变形或肿大染色质凝聚、破裂无典型特征解体DNA断裂为大小不等的片段细胞死亡时，随机降解随机降解特异酶Caspase活化自噬体包裹的物质被溶酶体酶水解消化溶酶体酶释放到胞质中ATP缺乏能否促发中度缺乏中度缺乏重度缺乏炎症反应无可诱发可诱发特征蛋白Caspase3,Bcl-2,cytochromeC,DAPcathepsinB,P13K,mTOR,LC3,DAPDAP生理意义生物体发育，抵御外界不良因子的干扰提供营养，是细胞凋亡途径的补充引起炎症反应，抵御外界不良因子三、细胞通路细胞凋亡细胞自噬：自噬主要是通过ULKcomplex磷酸化Beclin-1，激活脂酶VPS34，诱导了细胞自噬发生，因此可以通过ULKcomplex和Beclin-1的相关基因的抑制剂来抑制自噬的形成，包括的靶点有MAPkinases,JNK1,ERK和p38。同时，细胞自噬还涉及了多种信号通路，如哺乳动物雷帕霉素靶点mTOR信号通路，是依赖mTOR的相关信号通路形成自噬的重要途径。另外，其它信号通路中，如3-甲基腺嘌呤（3-MA）可以通过抑制ClassⅢPI3K的活性抑制自噬；GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬；死亡相关蛋白激酶（death-associatedproteinlinase,DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-relatedproteinkinase-1,DRP-1）诱导自噬。PKA、casein激酶Ⅱ、MAP激酶、calcium途径也在自噬错综复杂的调控网格中，但其机制还不甚清楚。细胞坏死四、检测方法细胞凋亡检测方法在之前已经讲过，此处就不列举了。细胞自噬检测方法：1.电镜观察：在透射电子显微镜下，可以观察到自噬的特征性变化即自噬泡及自噬溶酶体形成的全过程．首先在肿胀变形的细胞器周围出现双层膜空泡状结构，继而包裹待降解物质形成自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体2.单丹（磺）酰戊二胺(ＭＤＣ)染色法：MDC是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种非特异的检测自噬体方法。ＭＤＣ是自噬囊泡示踪剂，能与自噬囊泡膜上的ATG8特异性结合，因此其阳性结构可代表自噬囊泡，在荧光显微镜下可观察自噬囊泡的数量.3.特异蛋白或信号通路Westernblot检测：自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），这两种形式在正常细胞中都是存在的，而发生自噬的细胞中LC3-II会有明显的增加，因而可检测LC3-II的表达。另外，可检测以下信号通路蛋白：依赖mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）途径的自噬1）PI3K-AKT-mTOR信号通路2）AMPK-TSC1/2-mTOR信号通路其它的信号通路1）3-甲基腺嘌呤（3-MA）通过抑制ClassⅢPI3K的活性抑制自噬。2）beclin1和UVRAG作为正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与组成ClassⅢPI3复合物调控自噬。3）GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬；GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬。4）死亡相关蛋白激酶（death-associatedproteinlinase,DAPK）和DAPK相关蛋白激酶（DAPK-relatedproteinkinase-1,DRP-1）诱导自噬。5）PKA、casein激酶Ⅱ、MAP激酶、calcium途径也在自噬错综复杂的调控网格中，但其机制还不甚清楚。细胞坏死检测方法：1.电镜观察：在透射电子显微镜下，可以观察到坏死细胞体积及细胞器肿胀，细胞核稀疏成网状，细胞膜破裂引起内容物外溢等现象。2.凝胶电泳检测：提取DNA，可观察到DNA电泳条带呈弥散状，而非规则的梯状条带。3.AnnexinV-FITC/PI双染检测法：之前通常采用此方法对凋亡细胞与坏死细胞加以鉴别。凋亡早期，磷脂酰丝氨酸外翻，但膜具有完整性，因此凋亡细胞呈AnnexinV单标阳性。坏死细胞膜不具完整性，呈AnnexinV和PI双染阳性，但是近来AnnexinV和PI双染也被认为是凋亡晚期，因而此方法也不是太准确。