临床常见苛养菌的培养与鉴定.

临床常见苛养菌的鉴定与药敏无锡市第二人民医院第1页苛养菌概述1.苛养菌的基本特征：对营养要求较高，在普通培养基上不生长或难以生长的一类细菌体外培养需添加特殊因子或其他营养成分2.苛养菌分离和鉴定的基本要求：采用高营养的培养基，延长培养时间置于CO2或微需氧的环境，保持一定湿度不能随意丢弃无法鉴定的细菌，极有可能是苛养菌及少见菌第2页目录1.肺炎链球菌2.流感嗜血杆菌3.脑膜炎奈瑟氏菌4.淋病奈瑟氏菌5.布鲁氏菌属6.放线菌属第3页7.星形诺卡菌苛养菌8.溶血隐秘杆菌1.肺炎链球菌1.1概述1.2生物学性状1.3检测方法1.4药敏分析第4页1.5案例分析1.1肺炎链球菌-概述第5页1.肺炎链球菌社区感染常见病原菌之一，定植在正常人的鼻咽部。2.以肺部感染为主，大叶性肺炎多见。同时会导致耳部及鼻咽部的感染。严重时可继发胸膜炎、脓胸、脑膜炎和败血症。3.常见送检标本类型有痰、咽拭子、尿液、脑脊液、血液、穿刺液。4.肺炎球菌离开人体后很易死亡，痰培养分离率很低。易感人群：小于5岁及大于65岁肺炎链球菌疫苗1.2肺炎链球菌-生物学性状1.培养条件：CO2环境，哥伦比亚血平板。2.菌落形态：18-24h后血平板上形成草绿色溶血、灰色、半透明、圆形、针尖样、表面光滑（有些菌株可表现为粘液状）的菌落;培养48h后，脐凹状菌落。3.涂片染色：G+球菌,矛头状,成双或链状排列，尖端向外。第6页用放大镜观察1.2肺炎链球菌-生物学性状1.荚膜是肺炎链球菌的主要毒力因子之一。2.根据荚膜特异性多糖抗原性，分为近90个血清型，成人致病以1--9型及12型最多，其中3型毒力最强，常致严重肺炎。3.肺炎链球菌感染后，机体可建立较牢固的型特异性免疫，同型病菌的再次感染少见。第7页1.3肺炎链球菌-检测方法Optochin试验:敏感胆汁溶菌试验:阳性菊糖发酵试验:阳性荚膜肿胀试验：阳性触酶：阴性胆汁七叶甘：阴性甲型溶血链球菌(R)肺炎链球菌(S)第8页传统手工法1干扰肺炎链球菌叶酸的合成抑菌环直径≥14mm为敏感抑菌环直径≥18mm确认Optochin试验1.3肺炎链球菌-检测方法第9页乳胶凝集法2免疫学方法3基因检测法4质谱检测法5标本类型：菌液标本类型：尿液、脑脊液科研热点1.4肺炎链球菌-药敏分析第10页试验条件培养基：纸片扩散法：含5%绵羊血的MHA接种物：直接菌落悬滴法，相当于0.5麦氏标准孵育：35±2℃，5%CO2；20-24h纸片扩散法检测药敏建议报告抗生素种类：青霉素类：苯唑西林大环内酯类：红霉素磺胺类：复方新诺明喹诺酮类：左氧四环素类：四环素糖肽类：万古霉素增加使用D-抑菌圈试验或肉汤微量稀释法检测诱导型克林霉素耐药的信息。肺炎链球菌A组首选试验并常规报告红霉素C组补充试验选择性报告*阿莫西林青霉素（苯唑西林纸片）*阿莫西林-复方新诺明克拉维酸B组首选试验选择性报告*头孢吡肟*头孢噻肟*头孢呋辛*头孢曲松头孢洛林(非脑膜炎)克林霉素多西环素吉米沙星氯霉素左氧氟沙星莫西沙星*厄他培南氧氟沙星*亚胺培南*美罗培南泰利霉素利奈唑胺四环素万古霉素利福平诱导实验新增修订纸片扩散法1.4肺炎链球菌-药敏分析第11页用苯唑西林代替青霉素来进行纸片扩散法检测1.4肺炎链球菌-药敏分析第12页PRSP的筛选常规工作中可以用苯唑西林的纸片扩散法来检测青霉素的敏感性。苯唑西林抑菌圈直径≥20mm≤19mm判定青霉素为敏感可能是青霉素结果不可靠必须测定青霉素的MIC此法仅适用于无生命危险感染的患者。预测β-内酰胺类抗生素敏感1.4肺炎链球菌-药敏分析第13页β-内酰胺类抗生素K-B法未给出标准,推荐用MIC法1.4肺炎链球菌-药敏分析第14页MIC法试验条件方法：微量稀释法直接上机(GP-68）及E-test法接种物：0.5麦氏标准孵育：35±2℃，5%CO2；20-24h细菌生长区Etest塑料条椭圆形细菌生长抑制区2561288016判读抑菌浓度（MICug/ml)E-test法1.4肺炎链球菌-药敏分析第15页药物敏感中介耐药青霉素注射（非脑膜炎）≤24≥8青霉素注射（脑膜炎）≤0.06-≥0.12口服青霉素≤0.060.12-1≥21.脑膜炎分离株，需尽快用可靠方法检测和报告青霉素和头孢曲松(或头孢噻肟或美罗培南)的MIC值2.对于非脑脊液标本中分离出的肺炎链球菌，需同时使用脑膜炎和非脑膜炎的折点来报告青霉素的敏感性1.5肺炎链球菌-案例分析第16页患者：男60岁，因“突发高热，颈强直，脑膜刺激征，意识不清住院”。既往史：2008年脑科手术史，术后肺炎链球菌导致化脓性脑膜炎。入院后：脑脊液常规：白色，混，WBC:3.08*106脑脊液涂片:革兰阳性球菌脑脊液培养：草绿色溶血、灰色、圆形、针尖样、脐凹状菌落。Optochin试验:敏感,胆汁溶菌试验:阳性。治疗过程：入院后经验用药：头孢曲松（广谱三代，容易透过血脑屏障）获知涂片报告后，加万古霉素。两周后，预后较好。231452.流感嗜血杆菌2.1概述2.2生物学性状2.3检测方法2.4药敏分析第17页嗜血杆菌属（Haemophilus）副流感嗜血杆菌H.parainfluenzae溶血性嗜血杆菌H.paraphrophilus副嗜沫嗜血杆菌H.paraegyptius嗜沫嗜血杆菌H.aphrophilus杜克嗜血杆菌H.ducreyi流感嗜血杆菌H.influenzae第18页牙龈部定植性病软下疳呼吸道及全身感染心内膜炎亚急性心内膜炎口咽部定植2.1流感嗜血杆菌-概述第19页呼吸道继发感染原发感染鼻咽炎喉头炎急性气管炎肺炎、中耳炎、脑膜炎（2个月~3岁）心包炎、化脓性关节炎菌血症败血症1.流感嗜血杆菌社区感染常见病原菌之一，常引起急性化脓性感染，有荚膜的b型强毒株可以通过呼吸道飞沫传播。2.流感嗜血杆菌感染可分为原发性感染和继发感染。原发感染以小儿多见。继发感染：多是内源性感染，以成人多见。3.常见送检标本类型有痰、咽拭子、肺泡灌洗液、脑脊液、血液、穿刺液。2.2流感嗜血杆菌-生物学性状1.培养条件：需氧，CO2环境中，最适宜的培养基是巧克力平板（加入万古霉素和制霉菌素），不同嗜血杆菌对因子的需求不同。血平板上有卫星现象。2.菌落形态：35℃，18～24h培养形成微小、无色透明、不溶血，呈露滴样小菌落。3.涂片染色：革兰阴性小杆菌，无芽胞。粘液型菌株有荚膜。第20页X因子——血红素X因子为存在于血红蛋白中的一种血红素，为含铁的卟啉，耐高温，V因子——辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ血液中所含的V因子通常处于被抑制状态，经80～90℃加热10min后可使V因子释放2.3流感嗜血杆菌-检测方法第21页传统手工法1自动化方法2乳胶凝集法3免疫学方法4基因检测法5质谱检测法6卫星试验卟啉试验糖发酵试验吲哚快速法试验尿素酶试验2.3流感嗜血杆菌-检测方法金黄色葡萄球菌卫星试验X因子V因子V因子血平板MH平板流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌在血琼脂培养基上共同培养时可见卫星现象，因葡萄球菌能合成V因子，使其菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落较大，远离者则较小。细菌种类血平板MH平板需要因子流感嗜血杆菌+-X+V副流感嗜血杆菌++V2.3流感嗜血杆菌-检测方法第23页MH平板因子实验流感嗜血杆菌VXX+V副流感嗜血杆菌XX+VV黄色区域表示细菌生长细菌生长因子荚膜溶血吲哚脲酶触酶鸟AAXV流感嗜血杆菌：a～f型未定型＋+＋+＋－－－DDDD++DD副流感嗜血杆菌：三个型未定型－－＋＋＋－－－－－DD＋＋DD溶血嗜血杆菌++－＋D＋＋－副溶血嗜血杆菌－+－+－＋DD杜克氏嗜血杆菌＋－－D－－－－埃及嗜血杆菌+＋－－－＋＋－嗜沬嗜血杆菌+－－－－－－－副嗜沬嗜血杆菌－＋－－－－－－嗜血杆菌属根据吲哚、脲酶和鸟氨酸脱羧酶可分为8个生物型。2.3流感嗜血杆菌-检测方法未定型为无荚膜株B定型为有毒株2.4流感嗜血杆菌-药敏分析第25页仅用于流感流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌A组首选试验并常规报告氨苄西林C组补充试验选择性报告阿奇霉素克拉霉素阿莫西林氨曲南阿莫西林-克拉维酸复方新诺明头孢克罗2头孢丙烯2头孢克肟3头孢泊肟3B组首选试验选择性报告氨苄西林-舒巴坦头孢洛林头孢呋辛（口服）头孢呋辛2环丙沙星左氧氟沙星头孢噻肟头孢他啶头孢曲松莫西沙星氧氟沙星厄他培南亚胺培南氯霉素利福平泰利霉素美罗培南四环素试验条件培养基：纸片扩散法：嗜血杆菌试验培养基（HTM）肉汤稀释法：HTM肉汤接种物：直接菌落悬滴法，相当于0.5麦氏标准孵育：35±2℃，5%CO2；20-24h1.氨苄西林和阿莫西林是治疗流感嗜血杆菌的首选药物。2.β-内酰胺酶的检测可作为一种快速试验方便地检出流感嗜血杆菌对氨苄西林和阿莫西林的耐药性,常用的检测方法为显色头孢菌素法-头孢硝噻吩法，我院目前阳性率在20%左右。3.从脑脊液中分离的流感嗜血杆菌，常规中只报告氨苄西林、一种三代头孢菌素、氯霉素和美罗培南的试验结果。3.脑膜炎奈瑟氏菌第26页3.1概述3.2生物学性状3.3鉴别要点3.4药敏分析3.5案例分析3.1脑膜炎奈瑟氏菌-概述第27页1.脑膜炎奈瑟菌存在于携带者和脑膜炎患者的鼻咽部。2.通过飞沫经空气传播，冬末春初为流行高峰。感染后多数患者呈携带状态或隐性感染。3.少数出现呼吸道感染症状，仅极少数发展成败血症，累及脑膜，形成化脓性脑脊髓膜炎。4.人工培养物如不及时转种，超过48h常死亡。该菌能产生自溶酶，故采集时标本不宜放冰箱，应保温立即送检。5.根据脑膜炎奈瑟菌夹膜多糖抗原的不同，可分为A、B、C等13个血清群，我国主要是由A群和C群引起。3.2脑膜炎奈瑟氏菌-生物学性状1.培养条件：5%-10%的CO2,培养基：血平板和巧克力。2.菌落形态：光滑、凸起、半透明、湿润。3.涂片染色：革兰阴性球菌，肾形或咖啡豆状，凹面相对、成对排列位。脑脊液涂片时，常位于中性粒细胞内外。第28页3.4脑膜炎奈瑟氏菌-药敏分析第30页不必进行常规的药敏试验，临床耐药率不高。临床经验性用药通常有：青霉素是首选，对氯霉素，广谱的头孢菌素敏感。对临床细菌性脑膜炎经验治疗失败的细菌，都应该进行β-内酰胺酶过筛和MIC试验试验条件培养基：微量肉汤法：补充离子的MH肉汤，加2%-5%的冻融马血。琼脂稀释法：MH琼脂加5%的羊血。接种物：直接菌落悬滴法，相当于0.5麦氏标准。孵育：35±2℃，5%CO2；20-24h3.5脑膜炎奈瑟氏菌-药敏分析应该在生物安全柜中进行脑膜炎奈瑟菌的相关操作3.5脑膜炎奈瑟氏菌-案例分析患者：男，足月出生九天，因无明显诱因出现发热,拟“新生儿感染”收住入院儿科NICU。入院后：1.血常规：WBC10.01*09/L。脑脊液常规:无色透明，潘氏(+)，细胞计数0.316×109/L。2.血培养及脑脊液:血培养阳性，脑脊液培养阴性。送至CDC确认为B群脑膜炎奈瑟菌。3.咽拭子培养:3名密切接触者检出一株B群脑膜炎奈瑟菌株（系患者的外祖母）。4.药敏试验：对头孢三嗪、头孢噻肟、利福平、氨苄西林、四环素、米诺霉素、环丙沙星均敏感；而对磺胺甲基异噁唑、复方新诺明均耐药。治疗过程：予以独立病房隔离治疗，头孢曲松、青霉素抗感染及物理降温后，病情平稳。32144.淋病奈瑟氏菌第33页4.1概述4.2生物学性状4.3鉴别要点4.4药敏分析4.1淋病奈瑟氏菌-概述第34页1.淋病奈瑟菌侵入泌尿生殖系统繁殖，引起化脓性感染。胎儿可经产道感染造成新生儿淋病性急性结膜炎。2.实验室在运送淋球菌培养及涂片标本时要注意保温。3.出现耐头孢菌素的淋病奈瑟菌是一个重大的公共卫生问题。4.人是淋病奈瑟菌的唯一天然宿主。4.2淋病奈瑟氏菌-生物学性状1.培养条件：5%-10%的CO2,培养基：改良Thayer-Martin(MTM)培养基（加入万古霉素、多粘菌素、制霉菌素、三甲氧苄二氨嘧啶TMP）。2.菌落形态：灰白色、光滑、凸起、半透明。3.涂片染色：革兰阴性球菌，肾形或咖啡豆状，凹面相对、成对排列位。涂片操作时不要用力涂擦，应该在玻片上滚动。第35页直接涂片报告方式为：找到革兰阴性双