荞麦内转录间隔区(ITS)的扩增及序列分析-四川农业大学

1荞麦内转录间隔区（ITS）的扩增及序列分析生物科学2002级曾子贤指导老师吴琦副教授摘要：本研究以野生金荞麦、栽培苦荞为材料，采用改进的CTAB法提取荞麦总DNA。设计一对特异性引物，对三份荞麦ITS区序列进行PCR扩增，均获得长约700bp的单一条带。PCR产物测序结果表明，野生金荞麦1号测序片段为699bp，包含ITS区序列为660bp；野生金荞麦2号测序片段为678bp，包含ITS序列为646bp；苦荞测序片段为640bp，包括ITS序列为599bp。将所得到的三份荞麦ITS区序列分别与GenBank中登录的荞麦ITS序列进行比较。结果表明，野生金荞麦1号与已知金荞麦ITS区同源率为90.8%，野生金荞麦2号与已知的金荞麦ITS区序列同源率达到91.6%。供试苦荞与已知苦荞ITS区同源率为99.8%。关键词：野生金荞麦；苦荞；内转录间隔区（ITS）序列；5.8SrDNA；PCR；序列分析AmplificationandSequencesanalysisofInternalTranscribedSpacerofBuckwheatZENGZi-xianBiologicalScience,Grade2002DirectedbyWUQi(AssociateProf.Ph.D)Abstract：WildnessF.cymosumandcultivatedF.tataricumwereinvestigatedinthisarticle.BytheimprovingmethodofCTABDNAextraction,totalDNAfromthreebuckwheatwasobtained.Apairofspecificprimerswasdesigned.TheITSregionsofthreebuckwheatwereamplified.Theamplifiedfragments,about700bpinlength,weresequenceddirectly.Theresultsshowthatthesequencingfragmentsare699bp,678bpand640bpinlength,includingITSregionsofF.cymosumandF.tataricumare660bp,646bpand599bpinlength.ComparingF.cymosumandF.tataricumwithsequencesreported,itsuggeststhatthehomologyrateofITSsequenceofF.cymosum,NO.1is91.6%andNO.2is90.8%andthehomologyrateoftheITSsequenceofF.tararicumis99.8%.Keywords:WildnessF.cymosum;F.tataricum;ITSsequences;5.8SrDNA;SequenceAnalysis2荞麦属于蓼科（Polygonaceae）荞麦属（FagopyrumMill）植物。荞麦不仅是营养丰富的粮食作物，也是有较好药用价值的药用植物。因此开展荞麦属植物的系统发育和分子进化研究，进一步完善荞麦属植物的分类和新种、野生种的鉴定，对丰富的荞麦遗传资源保护和利用以及荞麦属植物的开发和改良提供系统学资料。KweonHeo等[1]对荞麦属的野生种进行了分类，将其划分为3大类（表1）。表1荞麦属的分类第1类F.esculentumF.homotropicumF.esculentum.Ancestralis第2类F.cymosumF.tataricumF.tataricum.potanini第3类F.callianthumF.capillatumF.gilesiiF.gracilipesF.leptopodumF.urophyllumF.lineareF.macrocarpumF.pleioramosumF.rubifoliumF.statice近年来，分子生物学研究技术如RFLP分析、AFLP分析、SSR分析、RAPD分析、DNA序列分析为分子系统学的研究提供了重要的分子标记资料。其中核糖体DNA内转录间隔区（ITS）序列分析已被广泛的用于植物属内、近缘属间的系统发育分析[2]。对于荞麦种间亲缘关系，国际上多从传统的形态学、种间可杂交性、同功酶、cpDNA、rDNA、rbcL、accD、RAPD和ITS等方面进行研究。植物基因组因其结构和功能上的差异，进化速率有所不同。核基因组(nDNA)进化最快，约为叶绿体基因组(cpDNA)的2倍，线粒体基因组(mtDNA)进化最慢，还不到叶绿体基因组的1/3[3]。由于cpDNA的进化速率远远低于nDNA，限制了其在较低分类阶元（如属、亚属）中的应用。因此，众多的研究者将注意力集中到nDNA中进化较快的DNA序列上，18S-26S核核糖体DNA（nrDNA）的内转录间隔区ITS(Internaltranscribedspacer）正是符合要求的序列之一。植物细胞核中，编码rRNA的基因是一些高度重复序列组成的多基因家族，其中，编码核糖体小亚基rRNA的18S基因与5.8S、26S基因共同构成一转录单位（图1所示）。其中，18S与5.8S、26S间的基因间区分别为内转录间隔区（ITS）1和2。也就是说，ITS区被5.8S分隔成ITS1和ITS2两个区域。ITS1和ITS2的转录物在rRNA加工的过程中被切掉，但这两部分在nrRNA成熟过程中具有重要作用［4］。3图1ITS区域结构（仿刘金姐2000）本实验通过GenBank中发表的荞麦ITS序列（AB000325-AB000329，AB000339，AB000340）比对，根据White等（1990）[5]所报道的4条经典ITS序列的引物,设计一对特异性引物，以三份荞麦总DNA为模板进行PCR扩增，用扩增产物直接测序（包括ITS1、5.8srDNA和ITS2），将这三份荞麦的ITS序列与GenBank中登录的荞麦ITS序列进行同源性比较和序列分析，为荞麦的系统演化以及荞麦的分类鉴定提供分子遗传学证据。1材料与方法1.1材料三份实验植物中，野生金荞麦（F.cymosum）1号采集于四川农业大学老板山，野生金荞麦（F.cymosum）2号和苦荞（F.tataricum）栽培种由成都高等烹饪专科技术学校唐宇教授提供。1.2试剂和仪器DNA提取液(50mmol/LTris-Cl，25mmol/LEDTA，300mmol/LNaCl，1%SDS，1%PVP)，无水乙醇，70%乙醇，氯仿和异戊醇（24：1），5mol/LKAc，TE（10mmol/LTris-Cl，1mmol/LEDTA，H2O），RNaseA，ddH2O，10×PCRbuffer，25mmol/LMgCl2，10mmol/LdNTPs，Taq酶（PCR扩增试剂均购自上海生工），GoldView（购自赛百盛），0.8%琼脂糖凝胶。Bio-Rad凝胶成像系统，EppendorfPCR仪，水平电泳仪，-20℃冰箱，制冰机，Thermo冷冻离心机，普通离心机，UnicoUV-2102C型紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，灭菌锅，研钵，离心管，冰盘。1.3方法1.3.1三份荞麦总DNA的提取采用在CTAB法[6]以及王莉花等[7]提取方法基础上改进的SDS微量快速提取DNA。1.3.1.1将100mg荞麦嫩叶放入置于冰上已灭菌的研钵中，再加入300μLDNA提取液充分研磨；18sNuclearrDNAITS15.8srDNAITS226sNuclearrDNAITSRegion41.3.1.2将磨细的样品转移到置于冰上的已灭菌的1.5mL离心管中，再向研钵中加入300μLDNA提取液并转入同一离心管中；1.3.1.3将离心管置于65℃水浴1小时，并不时轻轻上下颠倒离心管；1.3.1.4再加入125μL5MKAc冰浴30分钟，再向离心管中加入400μL氯仿/异戊醇（24：1），冰浴20min；1.3.1.5将样品于4℃下，4000rpm离心15min，取上清液并转入另一灭菌的离心管中，并加入2.5倍体积的无水乙醇，上下轻轻颠倒；1.3.1.6在4℃下，8000rpm离心4min，而后弃上清液；1.3.1.7用70%乙醇漂洗沉淀1-2次，放入50℃烘箱干燥15min；1.3.1.8用50μLTE溶解DNA，用含GoldenView的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，测定OD260及OD280,确定DNA的纯度及含量。置于-20℃冰箱中保存备用。1.3.2ITS序列引物的设计根据GenBank里已登陆的荞麦ITS序列AB000325-AB000329，AB000339，AB000340和YasuoYasui等[8]、White等[5]报道的引物序列，设计、选取出一对特异引物：Primer1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’Primer2:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’这对引物的扩增区包含了ITS1、5.8S和ITS2完整区域。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。1.3.3三份荞麦ITS序列的PCR扩增在赵晖等[9]报道的雪腐核盘菌ITS序列扩增体系及循环程序基础上，改进反应体系以及退火温度和延伸时间。采用PCR总体积50μL，反应体系如下：ddH2O38.5μL10×Buffer5μL25mmol/LMgCl22μLdNTPmixture1μL20umol/LPrimer11μL20umol/LPrimer21μL模板DNA1μLTaqDNA聚合酶0.5μL（5U）总体积50μL5按照上述顺序分别加入，反应循环程序：95℃3min94℃30sec52.5℃1min72℃55sec72℃10min4℃保存1.3.4PCR扩增产物的检测取5μLPCR产物与1μL6×Loadingbuffer混匀，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。1.3.5PCR产物直接测序将PCR产物直接送上海英骏生物技术有限公司纯化和测序。本实验选取的一对引物均位于ITS序列以外（图2），ITS1位于18srDNA，ITS4位于26srDNA[5]。因此直接采用下游引物进行单向测序，另一条链则以互补配对原则得出序列。图2ITS序列引物所在位置1.3.6ITS序列分析将三份荞麦rDNA的ITS序列的测序结果与已登陆的荞麦ITS序列（AB000325-AB000329，AB000339，AB000340）比较，确定ITS1和ITS2的范围。用生物信息学分析软件DNASTAR5.0对本实验序列及GenBank核酸数据库中荞麦属ITS序列进行比对和分析。2结果与分析2.1荞麦总DNA的提取实验所提取的野生金荞麦1号、野生金荞麦2号和苦荞总DNA经UnicoUV-2102C型紫外可见分光光度检测，三个样品的OD260/OD280分别为：1.9、1.8和1.8。野生金荞麦1号DNA有明显的RNA的污染，可通过电泳图分析，但已满足PCR反应对模板DNA纯度的要求。三份荞麦总DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3，条带较为清晰，完整性较好，可以用于PCR反应。30个循环}6图3荞麦总DNA电泳检测1.野生金荞麦1号；2.苦荞；3.野生金荞麦2号2.2三份荞麦ITS区的PCR扩增以总DNA为模板，利用所设计的引物Primer1和Primer2（图2所示ITS1和ITS4）PCR扩增出野生金荞麦1号、2号和苦荞ITS区的特异性条带。野生金荞麦1号、2号扩增片段大小约700bp左右，苦荞扩增片段略小于700bp与YasuoYasui（1998）[8]报道的荞麦属ITS区序列长度相近，结果见图4。图4三份荞麦ITS区PCR扩增图谱1.野生金荞麦1号；2.苦荞；3.野生金荞麦2号2.3三份荞麦ITS区序列所获得三份荞麦ITS区序列由于测序的原因，在ITS1上游可能有14bp-26bp处未能测出，ITS区全序列下游有55bp-58bp在ITS