乳酸菌细菌素提取与检测

实验一.乳酸菌细菌素的提取及检测一、实验目的1、利用综合性现代生物技术进行细菌素提取2、掌握细菌素提取、及细菌素检测的过程二、实验原理细菌素属于蛋白质，利用提取蛋白的原理同样可以适用提取细菌素，由于细菌素的化学本质是蛋白质,所以一般蛋白质的提纯方法都可以用于细菌素的提纯,但为了保持细菌素的生物活性,一般采用的是盐析的方法现在发现的细菌素一般都是胞外蛋白,所以提取的时候可以先离心除去菌体,然后加硫酸铵等盐处理上清液,离心并调节pH后即可以用快速琼脂糖阳离子交换柱等进行提取进一步的纯化则使用的是反相层析的方法此外,还可以运用高效液相色谱等进行微量的提纯细菌素的检验方法也很多依据细菌素的多肤本质,可以运用一些蛋白质的检验方法来对细菌素进行检验运用较多的是聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法,westem印迹法等JayA.Leversee(Leverseeandolatz,2001)等人还报道了一种运用兔子制备PLG-l(一种由丙酸杆菌产生的细菌素)的多价抗血清,使用免疫学方法检测PLG-1的方法,给细菌素的检测提供了一个很好的思路细菌素的活性检测方法亦很多,其中简单常用的方法是琼脂平板扩散法、牛津杯法和划线法等,这些方法大多都是通过抑菌圈的有无和大小来对细菌素的抑菌效果进行评价另外,在进行细菌素的活性检测时,要注意排除一些非特异性的抑菌因素的影响这些因素主要是微生物在生长代谢过程中产生的有机酸、氨、过氧化氢等。三、实验材料1.材料乳酸菌、大肠杆菌，LB固体或肉汤，MRS液体培养基2.主要试剂和仪器离心机、ph计、LRH-250A生化培养箱、牛津杯蛋白酶K、溶菌酶、过氧化氢酶、琼脂、NaOH、乙酸或乳酸四、实验步骤4.1细菌细菌素提取制备及鉴定4.1.1.细菌菌株的培养选取实验需要使用的乳酸菌菌株先用普通MRS固体培养基在37℃的温度下培养至长出菌落，再转移至液体增菌培养基进行增菌培养24h左右，待用。4.1.2.细菌素提取制备1．抑菌实验方法采用琼脂牛津杯法2．排除有机酸的干扰乳酸菌生长代谢过程中所产生的有机酸主要有乳酸和乙酸等,而酸性最强的最有可能具有抑菌作用的就是乙酸,因此在做抑菌实验的过程中,采用与发酵上清液同样pH值的乙酸作空白对照加以比较。3．排除过氧化氢的干扰采用过氧化物酶法。过氧化氢在过氧化氢酶的催化下可以氧化成生色底物,产生红色的产物,据此加以判断。4．排除离心上清液菌体残留细胞的影响将离心上清液用微孔滤膜(尺寸小25,孔径0.22林m)的细菌过滤器过滤除菌后做抑菌实验,排除离心上清液中残留的菌体细胞对抑菌实验的影响。5．蛋白酶处理将发酵上清液分别加入等体积的蛋白酶K(lm岁mL),37e恒温孵育30min,然后进行抑菌实验,方法同上观察其抑菌圈大小的变化以判断该抑菌物质是否为蛋白类物质。对照组第一组第二组第三组菌液离心后的上清液上清液加入除去有机酸、过氧化氢的上清液在第二组的基础上，加入蛋白酶K的上清液将上述三组菌液分别进行牛津杯实验，通过观察产生的抑菌圈来判断乳酸菌细菌素的蛋白质性质。五．实验结果分析讨论通过观察三组实验产生的抑菌圈大小及在排除细菌素中其他干扰因素后，来判断菌液中是否产生蛋白质性质的细菌素。