仪器分析实验指导书09

1实验一苯及其衍生物的紫外吸收光谱的测绘及溶剂对紫外吸收光谱的影响一、目的要求1．了解不同的助色团对苯的紫外吸收光谱的影响。2．观察溶剂极性对丁酮、异亚丙基丙酮的吸收光谱以及pH对苯酚的吸收光谱的影响。3．学习并掌握紫外可见分光光度计的使用方法。二、实验原理具有不饱和结构的有机化合物，特别是芳香族化合物，在紫外区（200~400nm）有特征吸收，为鉴定有机化合物提供了有用的信息。方法是比较未知物与纯的已知化合物在相同条件（溶剂、浓度、pH值、温度等）下绘制的吸收光谱，或将未知物的紫外光谱与标准谱图（如Sadtler紫外光谱图）比较，如果两者一致，说明至少它们的生色团和分子母核是相同的。E1带、E2带和B带是苯环上三个共轭体系中的的π→π*跃迁产生的，E1带和E2带属强吸收带，在230~270nm范围内的B带属弱吸收带，其吸收峰常随苯环上取代基的不同而发生位移。影响有机化合物的紫外吸收光谱的因素有：内因（共轭效应、空间位阻、助色效应）和外因（溶剂的极性和酸碱性）。溶剂的极性和酸碱性不仅影响待测物质吸收波长的移动，还影响吸收峰吸收强度和它的形状。2三、仪器紫外可见分光光度计（自动扫描型）石英吸收池容量瓶（10mL，5mL）吸量管（1mL，0.1mL）四、试剂苯、乙醇、氯仿、丁酮、异亚丙基丙酮、正庚烷（均为A.R）苯的正庚烷溶液（以1︰250比例混合而成）、甲苯的正庚烷溶液（以1︰250比例混合而成）0.3mg·mL－1苯酚的乙醇溶液、0.3mg·mL－1苯酚的正庚烷溶液、0.4mg·mL－1苯酚的水溶液、0.8mg·mL－1苯甲酸的正庚烷溶液、0.8mg·mL－1苯甲酸的乙醇溶液、0.3mg·mL－1苯乙酮的正庚烷溶液、0.3mg·mL－1苯乙酮的乙醇溶液异亚丙基丙酮分别用水、甲醇、正庚烷配成浓度为0.4mg·mL－1的溶液五、实验步骤1．苯及其一取代物的吸收光谱的测绘在五只5mL容量瓶中分别加入0.50mL苯、甲苯、苯乙酮、苯酚、苯甲酸的正庚烷溶液，用正庚烷稀释至刻度，摇匀。将它们依次装入带盖的石英吸收池中，以正庚烷为参比，从220~320nm进行波长扫描，得吸收光谱。观察各吸收光谱的图形，找出最大吸收波长λmax，并计算各取代基使苯的λmax红移了多少？2．溶剂性质对紫外吸收光谱的影响3（1）溶剂极性对n→π*跃迁的影响在三只5mL的容量瓶中，各加入0.02mL（长嘴滴管1滴）的丁酮，分别用水、乙醇、氯仿稀释至刻度，摇匀。将它们依次装入石英吸收池，分别相对各自的溶剂，从220~350nm进行波长扫描，制得吸收光谱。比较它们吸收光谱的最大吸收波长的变化，并解释。（2）溶剂极性对π→π*跃迁的影响在三只10mL的容量瓶中依次加入0.20mL分别用水、甲醇、正庚烷配制的异亚丙基丙酮溶液，并分别用水、甲醇、正庚烷稀释至刻度，摇匀。将它们依次装入石英吸收池，相对各自的溶剂，从200~300nm进行波长扫描，制得吸收光谱。比较吸收光谱的最大吸收波长的变化，并解释。（3）溶剂极性对吸收峰吸收强度和形状的影响在三只5mL的容量瓶中，分别加入0.50mL苯酚、苯乙酮、苯甲酸乙醇溶液，用乙醇稀释至刻度，摇匀。将它们依次装入带盖的石英吸收池中，以乙醇为参比，从220~320nm进行波长扫描，得吸收光谱。与苯酚、苯乙酮、苯甲酸的正庚烷溶液的吸收光谱相比较，得出结论。3．溶液的酸碱性对苯酚吸收光谱的影响在二只5mL的容量瓶中，各加入0.50mL苯酚的水溶液，分别用0.1mol·L－1HCl、0.1mol·L－1NaOH溶液稀释至刻度，摇匀。将它们分别依次装入石英吸收池，相对水，从220~350nm进行波长扫描，制得吸收光谱。比较它们的最大吸收波长，并解释。六、思考题1．举例说明溶剂极性对n→π*跃迁和π→π*跃迁吸收峰将产生什么影响？42．在本实验中能否用蒸馏水代替各溶剂作参比溶液，为什么？实验二紫外分光光度法测定芳香族化合物一、实验目的1、了解紫外吸收光谱在有机结构分析的应用；借助“标准吸收光谱图”鉴定未知物；2、学习有机物的定量分析方法。二、实验原理许多有机化合物在紫外具有特征的吸收光谱，从而可以用来进行有机物的鉴定及结构分析（鉴定有机化合物的官能团）；此外，还可对同分异构体进行鉴别。对具有π健电子及共轭双键的化合物特别灵敏，且在紫外光区具有强烈吸收。该法在有机物分析中可进行：（1）纯度检查；（2）未知样品的鉴定；（3）分子结构的推测；（4）互变异构的判别；（5）定量测定。三、仪器与试剂1、仪器：751GW型紫外-可见分光光度计；1cm石英比色皿2、试剂：苯酚，环己烷，10%NaOH四、操作步骤1、未知物的鉴定（1）在10mL比色管中取固体未知芳香化合物一小粒（约0.1mg），用5-10mL环己烷溶解，加塞摇溶为止。5（2）以空白为参比溶液，用1cm石英比色皿，于紫外分光光度计上以氢灯为光源，测定吸收曲线。测定波长从242nm开始，每隔4nm测一次到290nm为止。其中应注意以下几点：Ⅰ、测定时波峰谷处间隔1nm或0.5nm；曲线上升或下降部分可间隔2nm或更大一些。Ⅱ、从242nm连续向长波方向测定。每测定一个数据均需以参比溶液调节仪器零点及透光率100%；Ⅲ、防止参比溶液及环己烷溶剂污染。图一苯酚吸收光谱图（溶剂环己烷）2、酚的定量测定（1）配制标准系列：取酚标准溶液0.1mg/mL0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL分别置于50.00mL容量瓶中，各加10滴10%NaOH水溶液，用水稀释至刻度；6（2）绘制吸收曲线及标准曲线：用1cm石英比色皿，在波长242～290nm内每间隔4nm，以空白为参比，测定标准系列中3号（或4号）的吸光度A，绘制吸收曲线（按上面的注意所示），找出最大吸收波长λmax（与图一比较，有何不同；为什么？）用1cm石英比色皿，在选定的最大吸收波长下分别测定标准系列的吸光度，绘制标准曲线，以空白为参比；（3）测定未知液：取未知液10.00mL置于50.00mL容量瓶中，加10滴10%NaOH水溶液，用水稀释至刻度；用1cm石英比色皿，在最大吸收波长处测定吸光度A，以空白为参比。（4）计算未知液的含量（mg·mL-1）。【思考题】1、紫外吸收光谱在有机化合物分析中的特点。2、本实验与普通的分光光度法有何异同？7实验三、UV-2401PC紫外光谱仪的使用及氯霉素含量分析一、实验目的1．了解紫外光谱仪的结构和原理，学习紫外光谱仪的使用方法；2．了解氯霉素最大吸收峰波长的测定方法。3．掌握紫外光谱分析氯霉素浓度的原理和方法。二、UV-2401PC紫外-可见分光光度计(UV-VisSpectrophotometer)使用规程1．开机（顺序：稳压电源、光学台、电脑）。2．预热二十分钟后，在UVPCv3.9菜单下进入紫外－可见光谱测试程序，然后仪器进行自检。3．自检完后，在AcquireMode菜单下，选取Spectrum，设计参数4．放入样品，按Start进行自动扫描。5．在Manipulate菜单下，选PeakPick，用鼠标拉出隐藏的参数和最大吸收峰波长。6．在Presentation菜单下，选Plot,然后点Print，打印扫描谱图。7．在AcqurieMode菜单下，选Quantitative，对定量参数进行设计。8．放入样品，点Read，输入标准物浓度值。9．标准物做完后，点Unknown，做未知浓度样品。10．在Presentation菜单下，选Plot,进行图形位置设计，点Print，打印谱图。11．关机，顺序与开机相反三、氯霉素最大吸收峰波长的测定1.实验原理氯霉素具有消炎、镇静的作用，是一种抗菌素，分子结构较简单，其结构式为：氯霉素有两个手性碳原子，四个异构体统称为“氯胺苯醇”，由于氯霉素分子中含有π910大π键，氯霉素水溶液在λ=270nm左右的近紫HO2N—C—C—CH2OHOHNHCOCHCl2H8外区有一最大吸收峰，因此，在400-200nm的波长范围内即紫外区我们可测定氯霉素的最大吸收峰波长，如图1所示：2．仪器与试剂仪器：UV-2401PC紫外-可见分光光度计，50ml容量瓶6个,1000ml容量瓶1个,10ml吸液管1支试剂：氯霉素注射液（250mg/支）或氯霉素药片（50mg/片）3．操作步骤①氯霉素标准液的配制用氯霉素水剂1支（含氯霉素250mg），加水至1000mL配制成浓度为250ppm的氯霉素标准溶液。②氯霉素测定液的配制用10ml吸液管分别移取2、4、6、8、10ml的氯霉素标准溶液于5个50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，其浓度分别为：10、20、30、40、50ppm。③最大吸收峰波长的测定以40ppm的溶液为例，用石英比色皿取2/3到3/4体积的氯霉素测定液，用紫外-可见分光光度计在400-200nm波长范围内扫描得氯霉素吸光度与波长关系图（图1），找出最大吸收峰波长。从图1可知，随着吸收峰波长的下降，吸光度A增加到一个最大值后又下降，其最大值处即为最大吸收峰值。图1：氯霉素吸光度与波长关系图最大吸收峰波长λ最大在270nm左右。200300400λ(nm)吸光度A2.01.50.51.09四、氯霉素含量分析实验原理：由于氯霉素分子中含有π910大π键，在近紫外区λ=270nm左右有一最大吸收峰。当氯霉素浓度不太大时，在最大吸收峰处，氯霉素的浓度（C）与吸光度（A）具有线性关系：C=KA+C0例如：下面的表格数据就表示了氯霉素的浓度（C）与吸光度（A）具有的线性关系浓度ppm102030405060吸光度（A）0.40.81.21.62.02.4例：有一种氯霉素未知液，在最大吸收峰处，测得A=1.4，从表中可看出，氯霉素的浓度C=35ppm。如果说以上面的数据作吸光度（A）对浓度（C）的工作曲线图，图示（图2）如下：010203040500.00.51.01.52.0吸光度浓度/ppm图2氯霉素的标准曲线图从图2中亦可求出，氯霉素的浓度C=35ppm。①标准曲线图的绘制在最大吸收峰波长下，分别测定浓度为0、10，20，30，40，50ppm的氯霉素的吸光度A，绘制成工作曲线。②未知氯霉素溶液浓度测定10配制未知氯霉素溶液（浓度约在20-40ppm之间，以便在标准曲线内查找浓度），在最大吸收峰波长（前已测定的λ最大）下测定未知溶液的吸光度A值，根据A值在标准曲线上找出未知液的浓度或由计算机处理得出C未。五、数据记录及处理①最大吸收峰波第测定吸收波长（λ）最大吸光度（A）②标准曲线图的绘制浓度ppm01020304050吸光度（A）③未知液的测定在最大吸收峰波长下，测出未知液的A未=从工作曲线上查出：未知液的浓度：C未=五、注意事项1、紫外－可见分光光度计属大型精密仪器，必须由专人管理和使用；2、紫外－可见分光光度计管理人员每周至少开一次机或更换干燥剂，以除去机内湿气；3、易挥发、具有腐蚀性的样品、对主机内塑料或石英池有溶解作用的样品等应尽量少做或不做；4、要遵守紫外－可见分光光度计的操作规则：另外还注意1．全班共分6组，每组9人。2．实验报告按时交。3．服从教师指挥，不准随便乱动仪器，损坏仪器照价赔偿。4．进实验室必须换拖鞋，出实验室要把拖鞋套上，放入箱子里。5．值日生搞卫生，检查签名情况。6．石英比色皿只能拿毛面，不能拿光面，最后完成实验的同学清洗比色皿。11实验三荧光光度分析法测定维生素B2一、目的要求1．学习和掌握荧光光度分析法的基本原理和方法。2．熟悉荧光分光光度计的结构和使用方法。二、实验原理在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。以测量荧光强度和波长为基础的分析方法叫做荧光分光光度分析法。对同一物质而言，若alc0.05，即对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系F=2.3φfI0alc式中：φf—荧光过程的量子效率；I0—入射光强度；a—荧光分子的吸收系数；l—试液的吸收光程。I0和l不变时F=Kc式中K为常数。因此,在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。维生素