二氢青蒿素脂质体的制备

二氢青蒿素脂质体的制备温悦,毕小婷（第三军医大学大坪医院野战外科研究所药剂科，重庆400042）摘要目的：通过对二氢青蒿素脂质体的处方和制备工艺研究，研制高包封率和稳定的脂质体。方法：采用薄膜-超声法制备脂质体，以正交实验优化处方；测定了脂质体中药物的包封率；并初步考察了脂质体的稳定性。结果：优化处方与工艺所得脂质体形态均匀，包封率大于85%，载药量达30.09﹪，粒径约为20nm,具有良好的稳定性。结论：该制备工艺和处方可以制备出高包封率和稳定的双氢青蒿素脂质体。关键词二氢青蒿素；脂质体；包封率；质量评价PreparationofdihydroartemisininliposomesWENYue1，BIXiao-ting2（1.TheThirdMilitaryMedicalUniversity,DapingHospitalPharmacyInstituteofFieldSurgery,Chongqing4000422.HubeiYunyangMedicalCollegeofPharmacy,Shiyan442000）ABSTRACTOBJECTIVE：Togetastabledihydroartemisininliposomewithhightrappingefficiencybyselectingformulationandpreparationofdihydroartemisininliposome.METHODS：Thedihydroartemisininliposomeswerepreparedbyfilm-ultrasoundmethod.Theformulationwasoptimizedbyorthogonaldesign.Thetrappingefficiencyandthestabilityweredetermined.RESULTS：Thetrappingefficiencyofthedihydroartemisininliposomereached85%,thedrugamountedto30.09%andtheparticlesizeoftheliposomewas20nm,Theliposomehasgoodstability.CONCLUSION：Themethodcanbeusedtoprepareastabledihydroartemisininliposomewithhightrappingefficiency.KEYWORDSDihydroartemisinin；Liposomes；Trappingefficiency；Qualityevaluation二氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）是中草药青蒿的提取物青蒿素及其衍生物在体内的活性代谢产物和有效成分,是一种水溶性更好的青蒿素衍生物，其药理作用强度是青蒿素的4～8倍。研究表明，除有抗疟活性外，二氢青蒿素可抑制细胞血管内皮生长因子表达[1]，增强胶质瘤的放射敏感性，对人体乳腺癌细胞具有选择性毒性。有学者发现[2]二氢青蒿素对正常人乳腺细胞HTB125没有明显的细胞毒作用，但对放射抗拒的人乳腺癌细胞系HTB27表现了很强的杀伤能力。这个研究结果提示我们二氢青蒿素是一种很有前途的抗乳腺癌药物。脂质体的出现在抗肿瘤药物的研究中是一个有意义的突破。大量研究表明，脂质体作为药物载体可提高药物的治疗指数,降低或减少药物的不良反应[3]。包裹了二氢青蒿素的脂质体将脂质体的缓控释作用及内化快等特点集于一身，具有靶向治疗效果，不仅可以减少毒副作用产生，同时还可以保护二氢青蒿素在到达靶细胞或靶组织之前不被体内的活性物质所代谢而降低抗癌活性。为此，本实验采用薄膜-超声法[4]以大豆磷脂（注射用）、胆固醇为膜材，将二氢青蒿素制备成二氢青蒿素脂质体，并对其处方、工艺及有关性质进行了研究。1仪器与试剂1.1仪器RE-5298A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-500型医用超声清洁器（昆山市超声仪器有限公司）；Cs-15R低温离心机（美国贝克曼）；DU-650紫外分光光度计（美国贝克曼）；SPM-10A数字酸度计（浙江萧山仪器标准件厂）。1.2试剂注射用大豆磷脂（上海太伟药业有限公司，批号060727）；胆固醇（广州天马精细化工厂，批号050531）；二氢青蒿素（浙江义乌高登精细化工有限公司，批号051028）；其他试剂均为分析纯。2方法与结果2.1制备方法选择通过预实验对逆相蒸发法和薄膜-超声法进行比较，发现采用逆相蒸发法制备的二氢青蒿素脂质体比用薄膜-超声法制备的脂质体包封率低。笔者为获得较高包封率的二氢青蒿素脂质体，选择薄膜-超声法。2.2处方的优化选择2.2.1处方设计通过有关文献[5]及单因素考察实验，分析确定了影响二氢青蒿素脂质体包封率的三个主要因素，即大豆磷脂与胆固醇的质量比（A）、脂质与药物的质量比（B）和水合溶液（C），采用正交设计实验来筛选处方，各因素取三水平（见表1），以包封率和载药量为指标，选用L9（34）正交表安排实验，制备1～9号脂质体。表1因素水平Tab1Levelsoffactors水平因素ABC1233:14:15:12:15:18:1pH=6.0PBSpH=8.0PBS0.9﹪NaCl溶液2.2.2制备用薄膜-超声法制备，按表1中的处方组成，处方其余各原料用量固定。用圆底烧瓶称取大豆磷脂、胆固醇、二氢青蒿素，加入3ml三氯甲烷使之溶解，40℃减压旋转蒸发，转速为60r/min，使脂质体在瓶内壁均匀成膜，15min后即得干燥脂膜，备用。往上述薄膜中加入20ml水合溶液，置超声清洁器中超声60min，即得二氢青蒿素脂质体混悬液。2.2.3标准曲线的制备称取二氢青蒿素0.01g，置100ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀后静置2h，作为贮备液，浓度为0.101ug/ml。分别取该贮备液1，2，3，4，5ml置于25ml容量瓶中，加2﹪NaOH溶液-无水乙醇（体积比为4:1）混合溶液至刻度,摇匀，置60℃恒温水浴中反应30分钟，取出冷至室温，即得1～5号标准曲线样品。1～5号样品浓度依次为4.04，8.08，12.12，16.16，20.20ug/ml。通过预实验可知该样品溶液在237nm处有最大吸收，将1～5号标准曲线溶液在波长237nm处测定吸收度，以吸光度为x，浓度为y计算标准曲线，得标准曲线方程y=29.4125x－0.03973(r=0.9997)。2.2.4包封率的测定取适量二氢青蒿素脂质体混悬液13000r/min离心20min，分别精密量取离心上清液和未离心混悬液各1ml于两10ml容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀。静置2h后，各取3ml于两25ml容量瓶内，用2﹪NaOH溶液-无水乙醇（体积比为4:1）定容，摇匀，60℃水浴反应30min，取出冷至室温，待用。分别将各组离心和未离心稀释溶液在波长237nm处以同等条件下制得的相应空白脂质体的2﹪NaOH-无水乙醇溶液为空白测定吸光度，代入标准曲线方程y=29.4125x－0.03973(r=0.9997)，求得游离药物量（W游）和药物总量（W总）。根据公式：包封率=（W总－W游）/W总×100﹪，载药量=（W总－W游）/（W总－W游+W载）×100﹪计算二氢青蒿素脂质体的包封率和载药量。2.3结果以包封率和载药量为衡量指标进行直观分析，见表2。由方差分析（表3）可知：包封率的影响因素大小为B﹥A﹥C，，B对包封率有显著性影响，A、C无显著性影响，其最优水平搭配为A1(A2)B1C1；载药量的影响因素大小为B﹥A﹥C，其关键因素为B，对载药量有显著性影响，A、C无显著性影响，最优水平搭配为A1B1C1。综合上述分析，考虑到包封率及载药量这两个指标的重要性，因素A选取水平1；方差分析结果提示，实验中因素C对包封率和载药量均无显著性影响，并结合实际，磷酸盐缓冲液很易长霉,应尽量新鲜配制使用，而0.9﹪NaCl溶液简单易得，故C因素选取水平3，确定最优处方为A1B1C3。表2正交试验结果Tab2Resultsoforthogonalexperiment指标实验号因素包封率（﹪）载药量（﹪）ABC包封率载药量123456789K1K2K3RK1K2K3R111222333204.92204.92184.416.8453.9849.6245.222.92123123123247.34216.3130.6138.9191.1841.0616.5824.87123312231208.94190.15195.166.2651.4249.5847.821.285．7672．3546．8184．0570．8250．0577．5373．1333．75∑y=594.25y¯=66.03∑y2=41863.3132．2515．596．1430．1412．896．5928．7912．583．85表3方差分析结果Tab3Analysisofvariance指标方差来源离均差平方和自由度方差FP包封率ABC误差总计93.482436.9069.6226.312626.312222846.741218.4534.8113.153.5592.622.650.050.050.05载药量ABC误差总计12.79964.052.160.93979.93222286.4482.031.080.4613.91047.882.350.010.010.01F0.05(2,2)=19.00；F0.01(2,2)=99.002.4验证实验按优选工艺制备3批二氢青蒿素脂质体，包封率及载药量测定结果见表4,平均包封率为85.44﹪，RSD为0.61﹪，平均载药量为30.09﹪，RSD为1.10﹪，表明优选处方和工艺得到的二氢青蒿素脂质体稳定可行。光学显微镜下观察，所得3批脂质体形态圆整，粒径小而均匀。表4验证实验结果Tab4Experimentalverificationresults1号2号3号平均值（﹪）RSD（﹪）包封率85.1286.0485.1685.440.61载药量29．0130．6730．5930．091.102.5稳定性考察取一批二氢青蒿素脂质体混悬液分成两份，分别在4℃和室温条件下放置24小时，并分别对其包封率和载药量的变化进行考察，测定结果见表5。说明二氢青蒿素脂质体24小时内具有良好的稳定性。24小时内脂质体在4℃条件下保存，包封率和载药量几乎无明显变化，稳定性高于在室温条件下保存。表5二氢青蒿素脂质体的稳定性考察Tab5Stabilityinvestigationofdihydroartemisininliposomes放置时间（h）包封率（﹪）载药量（﹪）085.5585.2481.9030.0930.0229.624℃24室温242.6脂质体的质量评价2.6.1形态学研究取少量二氢青蒿素脂质体用0.9﹪NaCl注射液稀释,滴至载玻片于40×16倍光学显微镜镜下观察,视野里的脂质体密而多,脂质体粒径均匀且小。取少量脂质体滴至载玻片上,用磷钨酸负染,再滴至专用铜网上,自然挥干,使粒子在铜网上沉积,在电子显微镜下观察并照相,脂质体为粒径较均匀的球状或近球状小囊泡(见图1),粒径约为20nm。图1电子显微镜下二氢青蒿素脂质体（×10000000）2.6.2pH值的测定取适量二氢青蒿素脂质体混悬液置烧杯中，用数字酸度计测定其pH值，测得二氢青蒿素脂质体的pH值为5.79±0.01。3讨论本实验所用的膜材为大豆磷脂（注射用）和胆固醇，其中胆固醇的加入可调节膜的流动性，一定比例的胆固醇可减小膜的流动性，增加脂质体的稳定性，从而提高包封率。本实验表明在大豆磷脂（注射用）与胆固醇质量比为3:1时包封率较高。另外，本实验中药物与脂质的质量比是影响脂质体包封率的一个主要因素。在预实验中发现，药物浓度过高或过低都会影响其包封率，随着药物浓度的升高，包封率先增大后减小，提示二氢青蒿素脂质体的包封率可能具有饱和性[6]，一般情况下，药脂比越高，包封率和载药量也越