人参皂甙Rh2诱导人喉癌细胞株Hep2凋亡的研究

人参皂甙Rh2诱导人喉癌细胞株Hep-2凋亡的研究摘要!目的:研究人参皂甙Rh-2(G-Rh2)诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的作用。方法:应用流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳检测G-Rh2处理前后Hep-2细胞的凋亡情况,并应用SP免疫组化法检测药物处理前后相关基因产物Bax、Bcl-2蛋白的表达,观察G-Rh2对喉癌Hep-2细胞的诱导凋亡作用及其对细胞周期的影响。结果:(1)G-Rh2具有诱导凋亡作用,且呈量效、时效关系,细胞凋亡率随G-RH2浓度及作用时间的增加而升高,并可将细胞周期阻滞于G0/G1期。(2)G-Rh2处理Hep-2后,Bax表达上调,Bcl-2在G-Rh2处理前后无明显变化。结论:G-Rh2对体外培养的Hep-2细胞具有诱导凋亡的作用,其机制可能与上调Bax的表达及细胞周期阻滞有关。关键词!人参皂甙Rh-2;喉癌;细胞凋亡;细胞周期喉癌是常见的耳鼻咽喉恶性肿瘤,占耳鼻咽喉各种恶性肿瘤的第三位。目前,喉癌的治疗仍以手术为主,然后辅以化疗以延长患者生存率。而大量抗癌药物是通过诱导细胞凋亡而发挥其细胞毒作用的。所以,促进肿瘤细胞凋亡成为恶性肿瘤化疗的新目标。人参皂甙Rh2(Ginsenoside-Rh2,G-Rh2)是近年来从人参中分离出来的一种有效成分,属于人参二醇型四环三萜类低糖链皂甙单体,体内、外实验表明,它通过诱导分化或凋亡抑制肿瘤细胞的增殖,并证明其对正常组织毒性很低。本实验以人喉癌Hep-2细胞株为实验对象,研究G-Rh2通过诱导凋亡对Hep-2细胞株的抑制作用,从而为喉癌的临床治疗提供更多的实验依据。1材料与方法1.1细胞株及细胞培养人喉癌细胞株购于北京同仁医院耳鼻咽喉研究所,培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中(含100IU/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素),于37#、5%CO2恒温培养箱中培养,细胞呈贴壁生长,达80%左右时传代。传代用0.25%的胰蛋白酶消化。1.2药品与试剂G-Rh2购自吉林大学医学部天然药物化学研究室,制成针剂,浓度为20g/L、纯度∃98%,用时以RPMI1640培养液稀释为不同浓度。琼脂糖和吖啶橙购自Sigma公司,兔抗Bax多抗及鼠抗Bcl-2单抗购自武汉博士德公司,核糖核酸酶(RNase)和碘化丙啶(PI)购自华美生物试剂公司。1.3实验方法1.3.1流式细胞仪检测G-Rh2诱导凋亡的量效关系及细胞周期分析:取对数生长期的Hep-2以1%105cell/cm2接种于培养瓶中,贴壁培养24小时后弃去上清,处理组加入含不同终浓度(10、20、40、80
mol/L)G-Rh2的培养液,对照组加入等量培养液。培养24小时,经0.25%胰蛋白酶消化后,收集约1%106个细胞。PBS洗涤,制成单细胞悬液,用70%的冰乙醇4℃固定12h。于PI一步染色液中染色30min后做流式细胞仪分析。1.3.2流式细胞仪检测G-RH2诱导凋亡的时效关系:细胞取样、计数、培养同上。根据以往采用MTT法检测G-Rh2对Hep-2细胞的生长抑制作用的结果,其半数抑制浓度(IC50)为38.6μmol/L,因此我们选择40
mol/L(IC50的近似值)G-Rh2分别作用0、12、24、48h后,检测凋亡率。1.3.3琼脂糖凝胶电泳法:细胞取样、计数、培养、分组同上。37℃培养24h后终止培养,分别收集各组悬浮和贴壁细胞至1.5mlEP管中,每管用细胞裂解液500μl重悬细胞后加蛋白酶K至终浓度100μl/ml,50℃水浴3小时。经酚/氯仿抽提一次,2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA。1.2%的琼脂糖凝胶电泳约1小时,比较各组DNA电泳带型特点。1.3.4免疫组化:细胞取样、计数同上,接种于置有小盖片的24孔培养板中,实验组加入含G-Rh240μmol/l的培养液,对照组加入等量RPMI1640培养液。每组设3个复孔,于37℃孵箱内培养48小时后,收集细胞,制备细胞涂片。采用SP免疫组化法检测Bax和Bcl-2的表达,DAB显色,苏木素浅染,光镜下观察,以胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。1.4统计处理
采用X2检验进行统计分析。2结果2.1G-Rh2诱导Hep-2细胞凋亡的量效、时效关系采用流式细胞仪检测凋亡细胞,各处理组细胞凋亡率随G-Rh2浓度增高而递增,见表1。在40
mol/lG-RH2作用下,不同时间处理组细胞凋亡率随处理时间的延长而增高,见表2。2.2G-Rh2作用后细胞周期变化用流式细胞仪检测各期细胞数(每组检测10000个细胞),结果证明G-Rh2处理Hep-2细胞24h后,对G1期细胞的阻滞作用非常明显,见表3。2.3琼脂糖凝胶电泳结果细胞凋亡时,随着核酸内切酶的活化,DNA降解成寡聚核小体,这些降解片段均为180-200bp的倍数,通过电泳可形成典型的“梯状带”。无凋亡时,DNA未被降解,电泳形成单一的条带位于点样孔附近。本实验结果显示:20μmol/l、40μmol/l、80μmol/lG-Rh2组显示“阶梯状”条带(即“ladder”),对照组及10
mol/lG-Rh2组未见“ladder”(图1)。2.4免疫组化检测结果免疫组化结果显示,Bax阳性产物位于胞浆,对照组Bax表达呈弱阳性,G-Rh2处理后的细胞Bax表达水平提高(图2)。Bcl-2阳性表达可见于胞膜及胞浆,对照组和G-Rh2处理组均呈阳性表达,二者无显著性差异(图3-4)。3.讨论肿瘤的发生发展与细胞凋亡异常有极其密切的关系,因此细胞凋亡成为临床上体现对肿瘤实施化疗效果的一个重要指标。国内外许多学者通过体内外实验证实G-Rh2具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,但喉癌细胞方面则鲜见报道,本实验旨在阐述G-Rh2诱导喉癌细胞凋亡的机理,为喉癌的临床治疗提供更多的实验依据。本实验在采用流式细胞仪对G-Rh2诱导Hep-2细胞凋亡的研究中发现:Hep
2细胞的凋亡率在一定范围内具有随药物浓度增高而增高的趋势。由此提示:在一定范围内,G
Rh2诱导细胞凋亡呈剂量依赖性。根据Anodrew等的观点,细胞死亡是由正常的细胞周期改变引起的。细胞凋亡与细胞周期阻滞有关,细胞阻滞与哪一期,凋亡就发生在哪一期。本实验结果表明:各实验组G1期细胞数量增多,说明G-Rh2能阻滞G1期细胞向S期移行。在药物作用下,部分肿瘤细胞发生凋亡,未发生凋亡的部分细胞进入S期。这一结果与樊文华等在研究G-Rh2诱导肝癌Bel-7404细胞凋亡的作用时所得结果一致。在细胞凋亡的调控因子中,Bcl
2基因家族是重要成员,此家族共有三种基因:Bcl-2、Bax、Bcl-x基因,三者形成了一个凋亡调控系统:1、当Bax同源二聚体形成,便诱导凋亡;2、随Bcl-2蛋白表达量上升,越来越多的Bax二聚体分开,与Bcl-2形成比Bax-Bax更稳定的Bax-Bcl-2异源二聚体,从而“中和”了Bax-Bax诱导凋亡的作用,即细胞内Bcl-2与Bax的比例调节了凋亡的发生;3、而当Bcl-xS存在时,优先与Bcl-2形成异源二聚体,而使游离的Bax得以形成同源二聚体,便诱导了凋亡。通过本实验结果,我们认为G-Rh2在一定浓度范围内可诱导细胞凋亡,此作用与上调Bax蛋白有关。Bax表达增强,形成Ba-Bax同源二聚体的量增加,从而诱导凋亡。Bcl-2是否参与诱导Hep-2凋亡,根据本实验结果无法确定。这一结果与韩国学者的报道一致。通过以上结果,说明G-Rh2具有诱导Hep-2细胞凋亡的作用.其诱导凋亡作用可能与Bax表达上调以及阻滞细胞于G1期有关。