人及鼠神经干细胞体外培养特性的比较

人及鼠神经干细胞体外培养特性的比较(华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，430030)张传汉,祝畅,刘志恒，桂伶俐,高峰目的采用悬浮及贴壁培养法分离培养人及鼠神经干细胞（neuralstemcell，NSC），比较两者体外培养的生长及分化特性，为NSC的研究从动物回归人体进行有益的尝试。方法取孕9周及孕16周人胚、孕14天及新生Wistar大鼠的室管膜下区脑组织（各样本均进行三次以上独立试验），用1×105/ml及1×107/ml的密度进行悬浮原代培养，分别应用悬浮及贴壁培养的方法进行传代培养，悬浮培养的NSC用机械吹打法传代,贴壁培养的NSC用胰酶消化法传代。用免疫细胞化学的方法对所分离细胞的巢蛋白表达、自我更新能力和多向分化潜能进行鉴定。结果（1）取自鼠的原代培养物在以1×105/ml密度进行原代培养时，神经球的形成数目和生长速度明显优于以1×107/ml为起始密度的培养物，3～4天培养物中可见4～8个细胞组成的小神经球。1周时，大量桑椹状神经球形成（见图1）。而取自人的原代培养物在以1×107/ml密度进行原代培养时，神经球的形成和生长优于密度为1×105/ml的培养物。细胞密度为1×105/ml的人NSC原代培养物培养2周，几乎无神经球出现，细胞逐渐崩解死亡。（2）悬浮培养的鼠NSC3～4天传代一次，传至第6代左右细胞分裂开始减慢，培养50天左右，细胞分裂增殖停滞，逐渐死亡。贴壁培养的鼠NSC诱导贴壁快，2天后单个神经球可完全展开为单层，呈菊花状（见图3），鼠NSC贴壁培养60天左右，细胞分裂亦减缓，生长停滞。悬浮培养的人NSC1周左右机械吹打传代一次，培养90天左右细胞分裂增殖减慢。人NSC诱导贴壁需2～3天，大神经球的中心不能完全展开，仍保持有多层细胞（见图4）。贴壁培养的人NSC可稳定增殖4月余。（3）悬浮培养及贴壁培养的人和鼠NSC，经抗巢蛋白(nestin)及抗BrdU免疫细胞化学染色,均显示阳性(见图3、4)。加入5％胎牛血清诱导分化后，可显示出抗微管相关蛋白2（MAP2）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）染色阳性的细胞(见图5～8)，人与鼠NSC分化后2，3－环核苷酸磷酸二脂酶（CNP）的染色效果不佳。结论在对起始密度的依赖性、分裂增殖速度、培养维持时间、贴壁能力等方面，人及鼠NSC体外培养特性表现出较大差异，两者分化能力未见明显差异。贴壁培养较悬浮培养更有益于NSC的长期稳定增殖。关键词神经干细胞；人胚胎；大鼠；细胞培养