蒸发光散射检测器研究进展

蒸发光散射检测器（ELSD）研究进展摘要:简要介绍了蒸发光散射检测器（ELSD）的仪器构造、工作原理及其优缺点，系统总结了影响ELSD响应的各种因素，最后概述了ELSD的应用进展。关键词：ELSD；影响因素；应用进展目前，高效液相色谱仪日益普及，所分析的样品范围也越来越广。检测器作为高效液相色谱仪的重要组成部分，其发展在某种意义上决定着HPLC技术的进步。高效液相色谱检测器中除了最常用的紫外检测器之外，还有二极管阵列检测器，荧光检测器，示差折光检测器，蒸发光散射检测器，化学荧光检测器，质谱检测器，电化学检测器，拉曼光谱检测器，核磁共振检测器等。检测器的研究方向均是朝着灵敏度高，重现性好，响应快，线形范围宽，适用范围广，对流动相流量和温度波动不敏感，死体积小等方面发展。近年来ELSD在国内外广泛的应用于类酯、表面活性剂、糖、氨基酸、季铵盐、高聚物以及甾体化合物等的检测。现就HPLE-ELSD的研究进展作一简要概述。1仪器1.1仪器的首次出现1966年，Ford等第一次介绍了ELSD，当时它的名字叫蒸发分析器（evaporativeanalyzer），后又在其发展过程中被称为散射测浊器（nephelometer）、质量检测器（massdetector）、光散射检测器（lightscatteringdetector）等。首台蒸发光散射检测器（evaporativelight-scatteringdetec-tor;ELSD）是由澳大利亚的UnionCarbide实验室研制开发的，并在20世纪80年代初转化为商品[1]。1.2ELSD的结构、工作原理及特点目前，国内实验室常见的ELSD蒸发光散射检测器主要有：SEDERE的SEDEX55/60/75/80、AlltechAssociates的Alltech800/LTA和Alltech2000/LTA、PolymerLaboratories的PL-ELS1000和PL-ELS2100、Waters的Waters2420ELSD、SofTA的SofTAModel100/200/300/400ELSD、ESA的ChromachemELSD、EUROSEP的DDL31等种类[2]。对于各种已经商品化的ELSD主要由3部分组成：雾化器、加热漂移管和光散射池。1.2.1雾化器雾化器直接和分析柱的出口相连接，从柱后出来的流出液进入雾化器，在雾化器的末端与通入的气体（通常是氮气或氦气，也有空气）充分混合成均匀的小液滴，可以通过调节气体的流速和洗脱液的流速来调节所产生液滴的大小。对于ELSD的稳定性在很大程度上取决于雾化器气体流速，气体流速如果低于正常流速，会产生较大体积的液滴，大液滴会凝聚在加热漂移管上使响应值降低，大液滴中的流动相如果不能完全蒸发，则会形成尖峰；如果气体流速过高，则大液滴的数量会减少，响应值降低[3]。好的气源对于检测器的基线是一个很好的保证，如岛津检测器要求提供350kPa的气压，气源可采用空压机或钢瓶气[4]。1.2.2加热漂移管加热漂移管是ELSD的一个重要部件。柱流出物经过雾化器后变成气溶胶，然后经过加热漂移管。加热漂移管的作用是使气溶胶中的易挥发组分挥发，流动相中的不易挥发组分经过加热漂移管进入散射池。加热漂移管的温度对基线水平和噪声有明显影响：温度较低时，流动相不能完全蒸发掉，基线水平较高；温度过高时可能会带来更大的噪声[5]。加热漂移管温度的设定值应根据洗脱液的组成和性质而定[6]，在保证流动相完全蒸发的前提下设置尽量低的温度，特别是对于一些不稳定的化合物，更应该在低温下蒸发掉流动相。当雾化器中的气体流速比较大时，形成的气溶胶液滴比较小，加热漂移管的温度也就应该相应的低一些；如果气体流速比较小，形成的液滴比较大，加热漂移管的温度就应该相应的高一些。此外还要防止在加热漂移管中发生液滴之间的合并作用，否则就会由于流动相没有完全蒸发而引起信号的尖刺。1.2.3光散射池在光散射池中，样品颗粒散射光源发出的光经过检测器产生电信号。光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小和数量；当流动相和载气流速恒定时；散射光的强度仅取决于溶质的浓度[7]。ELSD光源有激光二极管和卤素灯两种。激光的长寿命使得避免经常更换灯源，也能有较好的重现性，如Alltech2000型ELSD为激光二极管，其强度在30000h工作寿命中是稳定的；激光源虽然强度较大，但有本征的缺憾，即对于一些具有生色基团的化合物，如果其吸收波长正好与激光光源波长相等，这种化合物就不会被检测到。卤素灯的波长宽但寿命短，目前，光源的发展趋势是使用单色性和能量更佳的激光二极管。经样品颗粒散射的光被光电倍增管或硅晶体光电二极管接收，光电倍增管价格便宜但灵敏度较低，逐渐被硅晶体光电二极管所取代。1.3检测步骤蒸发光散射检测器（ELSD）是强有力的检测工具，能检测挥发性比流动相低的任何样品。ELSD的检测依次分为3个步骤：雾化，从色谱柱中洗脱出来的组分和惰性气体混合，产生出包含流动相和样品的气溶胶；蒸发，作为气溶胶的流动相在通过加热的漂移管时被蒸发掉；检测，留下来的不挥发性样品颗粒和流动相蒸气通过一个光散射池，暴露在光照之下，用光传感器测定样品的散射光产生电信号，信号与样品的质量成比例关系。1.5ELSD检测器特点及其局限性ELSD检测器主要优点有：通用性强，ELSD的响应与被测物质的质量成正比，而不依赖于被测物质的光学特性及官能团，扩大了ELSD的应用范围；响应因子的一致性；灵敏度高于示差折光检测器和紫外末端吸收检测法；可进行梯度洗脱和消除流动相溶剂的干扰。ELSD检测器不足之处有：所检测的样品组分必须是非挥发性或半挥发性的，而流动相应是易于挥发的；与紫外、荧光检测器相比，灵敏度不够理想，检测限多在纳克（ng）级；对于某些样品，检测的线性范围较窄，样品量与峰面积有时不呈线性关系，定量分析较为复杂。2影响HPLC-ELSD检测性能的色谱条件及检测器参数2.1流动相组成流动相的挥发性越好，ELSD灵敏度越高。中性物质的分析，其流动相一般都具有较好的挥发性，但绝大多数酸碱化合物的检测都需要缓冲盐，缓冲盐挥发性差，会提高基线水平，增大基线漂移程度，从而降低信噪比。因此，缓冲盐既要易挥发，又要有较高纯度。通常使用的缓冲盐有醋酸、甲酸、三氟醋酸、硝酸铵、磷酸氢二铵等。2.2流动相流速在一定范围内，流动相的流速越低，流动相完全挥发所需的载气流速越低，形成的溶质颗粒越大，对激光散射能力越强，相应的检出信号越强。目前商品化的蒸发光检测器所使用的流速范围为0.1mL/min-5mL/min（标准HPLC），10L/min-150L/min（微径HPLC）[2]。2.3漂移管温度漂移管的温度一般设置在30~100℃，具体温度依流动相组成而定。温度升高，流动相蒸发趋向完全，信噪比提高；但温度太高会使流动相沸腾，增加噪音，同时高温可能使溶质部分升华，信号变小，降低灵敏度。当低于某一温度，流动相蒸发不完全，基线水平较高，尤其含盐流动相需要提高温度。总体来讲，温度低一些更好，这样有助于得到较大的颗粒，提高散射光的强度。故选择最佳温度应为在流动相基本挥发的基础上，产生可接受噪音的最低温度。不同的流动相根据不同的蒸发器设定合适的温度。2.4载气流速一般载气流速越小，形成的溶质颗粒越大，散射光的强度越大，但当载气流速太小时，流动相挥发不完全，增加背景噪音，降低信噪比。最优载气流速应是在可接受噪音的基础上，产生最大检测响应值时的最低流速。蒸发光检测器载气流量范围通常为0-5L/minn（氮气或氦气）[2]。3ELSD的应用ELSD在对类酯、表面活性剂、糖、氨基、季铵盐、高聚物、甾体化合物等物质的检测，以及药物分析方面发挥着重要的作用[8]。ELSD主要应用于[1]:（1）没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品；被广泛的应用于皂苷类成分、糖类成分、萜类成分、部分生物碱类成分以及其他一些成分的分析，取得了满意的结果。ELSD的响应与被测物的质量成正比，而不依赖于被测物的光学特性及官能团。理论上可用于挥发性低于流动相的任何组分的检测。（2）流动相有紫外吸收干扰或梯度洗脱时基线漂移影响的测定；用ELSD检测，流动相在漂移管便气化蒸发，不影响样品检测。3.1皂苷类成分的分析皂苷类成分大多没有紫外吸收，或仅在紫外末端有吸收，容易受到试剂的干扰，使皂苷测定在应用HPLC-UV法及选择流动相优化分离时均存在一定的困难。就目前情况看，ELSD应用于皂苷类成分的分析的例子比较多[9]，主要集中于黄芪甲苷，人参、三七皂苷，柴胡皂苷等的研究。HPLC-ELSD法在测定黄芪药材及其复方中黄芪甲苷含量时应用得最早最多。2005版《中国药典》中黄芪甲苷含量的测定便是采用该法，其灵敏度、稳定性及重现性均较理想。高建等[10]人采用HPLC-ELSD同时测定当归补血总苷中黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅱ，选用色谱柱KromailC18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为乙腈-水（37.5：62.5）；体积流量0.8mL/min；ELSD参数:漂移管温度100℃；N2气流体积流量2.60L/min。黄芪甲苷在0.85-6.76μg之间呈良好的线性关系(r=0.9992)，平均回收率为98.8%，RSD为1.50%；黄芪皂苷Ⅱ在1.05-8.4μg之间呈良好的线性关系(r=0.9994)，平均回收率为95.7%，RSD为2.70%黄海欣[11]建立该法测定复方丹参片中三七皂苷R_1、人参皂苷Rg-1、人参皂苷Rb-1的含量。3.2糖类成分的分析糖类成分多不存在紫外吸收，定量分析主要采用分光光度法，其缺点是只能测定总糖含量，灵敏度和准确度较差。近来有采用HPLC-ELSD方法对糖类成分进行分析的报道。罗进[12]等人建立同时测定食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的高效液相色谱-蒸发光散射法(HPLC-ELSD)方法，以Waters-NH2（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；乙腈:水=75:25（V/V）为流动相，流速为1.0mL/min，ELSD为检测器，漂移管温度45℃，N2流量25psi，在20min内完成了5种糖的分离，结果比较理想，可作为糖类食品的质量控制和安全评价的测定方法。3.3生物碱类成分的分析皮慧芳[13]等人以HypersilODS（250mm×4.6mm，5μm）为色谱柱，流动相甲醇（含0.05%三乙胺）-水梯度洗脱，流速为1.0mL•min-1，记录时间60min；以ELSD检测，检测条件漂移管温度75℃，氮气流速1.9L•min-1条件下对湖北贝母花中的生物碱成分得到很好的分离。王怀玉[14]等利用HPLC-ELSD很好地测定不同生长年限太白贝母鳞茎中总生物碱的含量，为建立和完善中药材太白贝母的质量控制体系和适宜采收时间提供实验依据。3.4萜类成分的分析银杏萜类内酯具有扩张冠状动脉血管，增大脑血流量等作用，是银杏的重要活性成分，而倍受国内外学者的重视。银杏叶所含的内酯有效成分二萜内酯和倍半萜内酯，需用紫外低波长检测；且含有少量酚性物质，紫外吸收强，会对测定产生很大影响，即使经过复杂的前处理，效果亦不理想。RI法是目前银杏萜类内酯常用的测定方法，但灵敏度低及基线稳定性差，ELSD有逐步将其取代的趋势。肖飞[15]采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定出银杏叶片银杏萜类内酯A、B、C及白果内酯含量，方法简便，快速，准确，稳定性和重复性较好。3.5氨基酸的分析氨基酸成分的分析多采用氨基酸分析仪或采用衍生化法[16]，用氨基酸分析仪测定，样品处理较复杂；柱前，柱后衍生又易产生误差。采用PrevailTMC18色谱柱（250mm×416mm.id.，5μm），以乙腈-017%三氟醋酸溶液（含5.0mmol/L七氟丁酸）为流动相进行线性梯度洗脱，流速为0.8mL/min，在漂移管温度115℃、氮气流量2.5L/min条件下，在25min内即可完成对阿胶中17种氨基酸的分离测定[17]。王玉红等[18]也建立了HPLC-ELSD直接测定分析20种未衍生基本氨基酸。3.6磷脂检测磷脂是一