protein-A与proteinG的区别

中文名称重组纯化蛋白A英文名称RecombProteinA蛋白A是从A类Streptococci细菌中分离出来的胞壁蛋白，与多数哺乳动物的IgGFc段结合（包括：人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等）。不与狗IgG结合、不结合人IgM、IgD、和IgA。重组蛋白G（RecombProteinG）已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结合。因此，它比天然蛋白G和蛋白A有更大的亲和力。可以代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域。在亲和力、稳定性等方面好。蛋白A是从非致病性Bacillus中获取的通过基因工程生产的重组蛋白，其性质和重组蛋白G相似。英文名称RecombProteinG中文名称重组纯化蛋白G蛋白G是从G类Streptococci细菌中分离出来的胞壁蛋白，与多数哺乳动物的IgGFc段结合（包括：人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等）。不与狗IgG结合、不结合人IgM、IgD、和IgA。重组蛋白G（RecombProteinG）已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结合。因此，它比天然蛋白G和蛋白A有更大的亲和力。可以代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域。在亲和力、稳定性等方面好。蛋白A是从非致病性Bacillus中获取的通过基因工程生产的重组蛋白，其性质和重组蛋白G相似。蛋白A、蛋白G是微生物来源的天然蛋白质，可以和哺乳动物的免疫球蛋白结合,基于这一特性，蛋白A、蛋白G的主要应用是在：1纯化抗体:将这些蛋白偶联于支持物上，提供了纯化抗体的有效方法。2免疫沉淀(immunoprecipitation):利用蛋白A、蛋白G和免疫球蛋白的Fc段的结合，把Ag-Ab复合物分离出来，从而达到从蛋白复合物中分离出特定蛋白进行下一步的研究分析或者研究蛋白质-蛋白质之间的相互作用。3去除或减少非特异性背景：如免疫沉淀技术中在加入特异性抗体前加proteinA/Gbeads到细胞裂解液中，以减低背景。蛋白A、蛋白G与不同的免疫球蛋白的结合能力并不一样，它们受到后者的来源及亚类的影响。proteinAagarose和proteinGagarose之间主要的区别是什么？它俩跟免疫球蛋白结合的机理？ProteinA:天然的ProteinA，42kDa，含有四个IgFc结合位点，其中2个是有活性的。而用于纯化抗体的，一般是重组的proteinA，含有4个IgFc区域结合位点。ProteinG：是由G群链球菌株产生的一种细胞壁成分，可结合很多种免疫球蛋白的Fc部分。ProteinG对不同种属Ig或同一种属的不同型Ig均表现出不同的亲和力。和ProteinA对比ProteinG对于某些亚型的IGG抗体结合力更强。ProteinG能结合所有的人和鼠的IGG抗体亚型，包括鼠的IGG1。ProteinG也可以与小鼠的IGG2a和IGG2b结合，而ProteinA则不能。ProteinA柱之进化Protein本帖引用网址：是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。因而，将ProteinA与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可制备用于抗体纯化的亲和填料。早期的ProteinA柱结合的都是天然ProteinA。天然ProteinA由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成，分子量约42KD，结构如图1所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量的lgG。但同时，天然ProteinA的其他非结合域会和非目标蛋白结合，这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够，会影响到后续的试验。为了解决这些问题，科学家们运用基因工程技术，克隆出ProteinA的基因，并对其进行改造，除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组ProteinA的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中，的确是提高了产物的纯度。目前，市场上绝大部分重组ProteinA柱都是这种产品。但是，纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液，如果洗脱效果不是很理想，还要降低pH，采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见，此法洗脱条件比较剧烈，最后收集的蛋白质很有可能变性，或者是复性困难。这种洗脱条件剧烈的ProteinA柱结合的重组蛋白质A一般具有5个串联结构域：E、D、A、B、C。这种重组蛋白A虽然除去了不重要的非结合域，仅由5个结构域组成，每个域均可以和IgG的Fc段结合，但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一，而且经常需要较低的pH值。如果减少串联结构域的个数，并且采取同型结构域串联，就可以避免不同结构域与抗体Fc段亲和性的差异，洗脱条件会温和而均一。为此，我们可以做一个试验，比较一下这两种蛋白质A柱纯化的结果。待纯化样品：人血浆实验材料：GE公司的rProteinASepharoseFF（E、D、A、B、C结构域串联）Putus公司的rProteinASepharoseFF（3个B结构域串联）实验方法：分别按照每个公司的说明书来操作，洗脱条件分别为pH值3.0和4.5，SDS-PAGE检测结果如下：Marker97.2k66.4k44.3k29.0k20.1k14.3kSDS-PAGEResult上图从左边起，泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为经过GE填料洗脱后抗体，泳道3为经过Putus填料洗脱抗体，泳道4为人血浆。从图中，我们可以看出，与拥有5个异型结构域的rProteinASepharoseFF填料从人血浆纯化抗体纯度比较，拥有3个同型结构域的填料纯化的抗体纯度更高。更重要的是，后者的洗脱条件仅为4.5，高于前者的洗脱条件3.0。使用具备较少B结构域的ProteinA柱能获得高纯度的IgG，并且洗脱条件温和，从而能防止蛋白质聚集，保护蛋白质活性。