突破衍射极限的超高分辨率成像技术发展-(修改)

1结课论文题目突破衍射极限的超高分辨率成像的技术进展学生姓名学号学院专业班级二〇一五年十二月2一引言1.1选题意义光学显微成像具有极为悠久的历史，但一直以来，光学成像一直受到衍射极限的限制而分辨率无法突破200nm。后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，但是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。值得庆贺的是近年来，超高分辨率显微技术的发展使得光学显微成像分辨率达到了20nm以下。其中德国科学家StefanHell、美国科学家EricBetzig和WilliamMoerner因其在超高分辨率显微技术方面的突出贡献获得了2014年的诺贝尔化学奖。在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术的发展和应用，并对诸位大师致以敬意。1.2技术指标显微技术成像优劣一般通过X-Y平面分辨率与Z轴分辨率大小来判定，分辨率越高数值越小。下表是各种显微成像技术的分辨率指标。成像技术X-Y平面分辨率（nm）Z轴分辨率(nm)普通光学显微镜200-300500-7004Pi显微镜100-150STED显微技术50-70STED+4π技术5050PALM技术20303DSTORM技术20-3050-60dSTORM技术30502DSSIM技术503DSSIM技术100200电子显微镜0.05X光衍射仪0.03-103二衍射极限2.1衍射极限我们能看到什么？看到多小的范围？看得有多清楚？几百年来，依靠不断进步的科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以看得越来越“小”，进而可以进行研究。人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物体，再小，就要借助工具。1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究的光学显微镜，用它观察薄薄的软木塞切片。虎克看到了残存的植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起，这就是“细胞”一词的由来。此后，显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，帮助科学家第一次发现了细菌和微生物。那么，光学显微镜是否可以无止境地“放大”下去，让我们想看到多小就能看到多小？科学家为此做了很多尝试，最终发现，存在一道法逾越的“墙”—衍射极限。1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光是一种电磁波，由于存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近，弥散斑就叠加在一起，我们看到的就是一团模糊的图像。阿贝提出，分辨率的极限近似于入射光波长的二分之一(d=λ/2)。可见光的波长通常在380~780纳米之间，根据衍射极限公式，光学显微镜的分辨率极限就在200纳米（0.2微米）左右。如果物体小于0.2微米，你仍旧看到的是一个模糊的光斑。这就是很长一段时间内，光学显微镜的分辨极限——衍射极限。2.2突破衍射极限为了更深入的观察世界，后来有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，人们借助它们可以看得更“细”。但是这些设备依然没有突破衍射极限，他们依然遵循着阿贝衍射极限。这些设备使用的是电子束等4波长非常短的入射光，自然，它们的分辨率就高。比如电子显微镜，分辨率可以达到0.5埃（一埃等于十分之一纳米），这样就可以看到一粒一粒的原子。由于生物学、医学方面的研究，更希望在生命体存活的自然状态下进行观察，在这方面，光学显微镜有它不可比拟的优势。因此，光学显微镜的研发还是世界科学家的研究热点。突破性的进展发生在本世纪初，近年来，随着新的荧光探针和成像理论的出现，研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率的三维超分辨率成像方法。较成熟的有基于单分子成像的超分辨率显微成像方法，包括光激活定位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)和随机光学重构显微技术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM)。以及两大类通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率的方法，分别是受激发射损耗显微技术(stimulatedemissiondepletion,STED)和饱和结构照明显微技术。(参考文献：吕志坚，陆敬泽.几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展)以上这些进展,都让光学显微镜突破了衍射极限，我们称之为“超分辨成像技术”。美国光学学会把它列为21世纪光学五大研究计划之首。5三超高分辨率显微技术3.1光激活定位显微技术PALM当显微镜需要分辨两个或者更多点光源的时候，很难突破光学分辨率的极限来进行精确定位．而当显微镜的物镜视野下仅有单个荧光分子的时候，通过特定的算法拟合，此荧光分子位置的精度可以很容易超过光学分辨率的极限，达到纳米级．如上所述，尽管单分子的定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时的分辨率．2002年，Patterson和Lippincott-Schwartz首次利用一种绿色荧光蛋白(GFP)的变种(PA-GFP)来观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹．这种荧光蛋白PA-GFP在未激活之前不发光，用405nm的激光激活一段时间后才可以观察到488nm激光激发出来的绿色荧光．德国科学家EricBetzig敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限．2006年9月，Betzig和Lippincott-Schwartz等首次在Science上提出了光激活定位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)的概念．其基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子．在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来．之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环．这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位．将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术，如图1所示。PALM显微镜的分辨率仅仅受限于单分子成像的定位精度，理论上来说可以达到1nm的数量级。2007年，Betzig的研究小组更进一步将PALM技术应用在记录两种蛋白质的相对位置，并于次年开发出可应用于活细胞上的PALM成像技术来记录细胞黏附蛋白的动力学过程。（参考文献：PattersonGH,Lippincott-SchwartzJ.AphotoactivatableGFPforselective6photolabelingofproteinsandcells；BetzigE,PattersonGH,SougratR,etal.Imagingintracellularfluorescentproteinsatnanometerresolution；ShroffH,GalbraithCG,GalbraithJA,etal.Dual-colorsuperresolutionimagingofgeneticallyexpressedprobeswithinindividualadhesioncomplexes）图1：应用PALM技术定位单个荧光分子最后实现超分辨率成像的示意图A，B，C，D，E，F展示了实际实验过程及得到的原始数据；A′，B′，C′，D′，E′，F′展示了用高斯拟合确定荧光分子的中心，叠加产生了超分辨率图像；(A,A′)未激活任何荧光分子时；(B,B′)用405nm的激光激活了4个荧光分子；(C,C′)用488nm的激光观察一段时间后漂白了第一轮激活的4个荧光分子；(D,D′)第二轮重新激活的另外的几个荧光分子；(E,E′)两轮激活的荧光分子总和组成的图像；(F,F′)E图的局部放大3.2多色随机光学重构显微法PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力。但是利用化学小分子Cy3和Cy5、Cy7等荧光分子对的光转换效应同样可以达到突破光学极限的效果。这项技术被称为“随机光学重建显微术”(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM)。其发明人是哈佛大学的庄小威教授。这项技术是用很弱的光激发荧光分子，使细胞内的一小部分荧光分子发光，而不是全部。这样由于发光的点分布比较分散，重叠比较少，因此每个光晕可以近似为一个荧光分子。在一次激发中，可以确定一部分光晕的中心，在下一次激发中，可以确定另外一部分光晕的中心，把这许多次激发的结果叠加，就是完整而清晰的图像（图2）。因此，STORM需要利用荧光发色团标记抗体对靶蛋白进行识别，可以检测到内源性蛋白，避免由于外源性表达偶联荧光蛋白的靶蛋白对其定位产生的可能的影响，但是在活细胞应用中受到限制，并且也有可能受到免疫荧光染色过程的影响。随后，他们又利用光学像散性实现了3DSTORM，达到了平面20~30nm，纵向50~60nm的成像精度。7（参考文献：夏鹏，窦震.超高分辨率显微技术研究进展；HuangB,WangW,BatesM,etal.Three-dimensionalsuperresolutionimagingbystochasticopticalreconstructionmicroscopy）利用某些荧光小分子自身可被反复激发淬灭的性质，通过与STORM相似的操作方法，可以实现单一荧光分子的超高分辨率成像，这一方法大大简化了原始STORM的样品制备过程，被称为dSTORM(directSTORM)。值得一提的是，庄小威研究组将SNAP标签与靶蛋白融合表达，同时将荧光分子偶联到可以结合SNAP标签的小分子化合物上，进而标记靶蛋白，再通过降低溶解氧消耗系统以及脂肪族巯醇的添加量，成功地在三维超高分辨率的成像中实现了空间分辨率平面30nm，轴向50nm，时间分辨率1~2s的优异效果。有意思的是几种细胞膜标记物也被鉴定出具有光转换性质，并被用于超高分辨率显微成像，在活细胞中得到了30~60nm的空间分辨率和1~2s的时间分辨率。最近，基于ImageJ的PALM/STORM数据处理插件已经发布，为这两种关键技术的应用提供了极大便利。（参考文献：HeilemannM,vandeLindeS,SchuttpelzM,etal.Subdiffraction-resolutionfluorescenceimagingwithconventionalfluorescentprobes；杨光.随机光学重建显微中的光学设计与数据处理）但是，STORM方法也存在缺陷，由于用抗体来标记内源蛋白并非一对一的关系，所以STORM不能量化胞内蛋白质分子的数量，同时也不能用于活细胞测量。（参考文献：毛铮乐，王琛.超分辨远场生物荧光成像-突破光学衍射极限）图2：随机光学重构显微技术效果图83.3STED受激发射损耗显微术在1994年，Stefan提出了一种理论，利用受激辐射损耗原理，将一束由相位调制产生的空心环形激光围绕激发光，导致环形区域内的分子受激辐射，而只有光束中心部分的荧光分子被激发光照射产生自发辐射，进而被独立检测出来。随着环形激光强度不断升高，其孔径也相继减小，藉此突破光学极限(图3)。他们将这种显微镜技术命名为STED(stimulatedemissiondepletionmicroscopy)。几年后他在哥廷根大学制造出了这种显微镜，将xy轴分辨率水平从200nm提升到了70nm左右(图3)，成功地打破了光学分辨率极限。随后，Hell领导的研究组又通过将STED与4Pi结合以及通过两种相位调制的方法，将其从二维成像扩展到三维(3DSTED)，实现了xyz三个方向上的超高分辨率成像。由于STED技术以共聚焦显微镜为基础，因而在成像深度上具有很大的优势，实