中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验方法微生物指标

中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验方法微生物指标Standardexaminationmethodsfordrinkingwater一Microbioloicalparameters1、菌落总数1.1平皿计数法1.1.1范围本标准规定了用平皿计数法测定生活饮用水及其水源水中的菌落总数本法适用于生活饮用水及其水源水中菌落总数的测定。1.1.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。1.1.2.1菌落总数standardplate-count加cteria水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1ml水样所含菌落的总数1.1.3培养基与试剂1.1.3.1营养琼脂1.1.3.1.1成分：A蛋白陈10gB牛肉膏3gC氯化钠5gD琼脂10g——20gE蒸馏水1000ml1.3.1.2制法：将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4一7.6，分装于玻璃容器中（如用含杂质较多的琼脂时，应先过滤），经103.43kPa(121℃，15lb）灭菌20min，储存于冷暗处备用。1.1.4仪器1.1.4.1高压蒸汽灭菌器。1.1.4.2干热灭菌箱。1.1.4.3培养箱36℃士2℃。1.1.4.4电炉。1.1.4.5天平。1.1.4.6冰箱。1.1.4.7放大镜或菌落计数器。1.1.4.8pH计或精密pH试纸。1.1.4.9灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等1.1.5检验步骤1.1.5.1生活饮用水1.1.5.1.1门以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注人灭菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照1.1.5.1.2待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃士1℃培养箱内培养48h，进行菌落计数，即为水样1ml中的菌落总数1.1.5.2水源水1.1.5.2.1以无菌操作方法吸取lml充分混匀的水样，注入盛有9ml、灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:10稀释液。1.1.5.2.2吸取I:10的稀释液工ml注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成l：10稀释液。按同法依次稀释成l:1000,l:10000稀释液等备用。如此递增稀释一次，必须更换一支1mL灭菌吸管。1.1.5.2.3用灭菌吸管取未稀释的水样和2个——3个适宜稀释度的水样1ml，分别注入灭菌平皿内以下操作同生活饮用水的检验步骤。1.1.6菌落计数及报告方法作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。1.1.7不同稀释度的选择及报告方法1.1.7.1首先选择平均菌落数在30一300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例1）1.1.7.2若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30一300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数（如表1中实例2）若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数（如表l中实例3）若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数（见表l中实例4）。1.1.7.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例5)1.1.7.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表l中实例6）。1.1.7.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30——300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例7）。1.1.7.6若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之1.1.7.7如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1cm翌中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数．乘以皿底面积63.6cm2，再乘其稀释倍数作报告。1.1.7.8菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五人方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（见表I“报告方式”栏）中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验方法微生物指标Standardexaminationmethodsfordrinkingwater一Microbiolo只icalparameters2、总大肠菌群2.1多管发酵法2.1.1范围本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。2.1.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准2.1.2.1总大肠菌群totalcoljforms总大肠菌群指一群在37℃培养2h能发酵乳搪、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌2.1.3培养基与试荆2.1.3.1门乳糖蛋白膝培养液2.1.3.1.1成分A蛋白陈10gB牛肉膏3gC乳糖5gD氯化钠5gE嗅甲酚紫乙醇溶液（16g/L)1mLF蒸馏水1000ml2.1.3.1.2制法将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2——7.4，再加人1ml16g/l的澳甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95kPa(115℃，10lb）高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用2.1.3.2二倍浓缩乳糖蛋白膝培养液按上述乳糖蛋白陈培养液〔2.1.3.1)，除蒸馏水外，其他成分量加倍。2.1.3.3伊红美蓝培养基2.1.3.3.1成分A蛋白陈10gB乳糖10gC磷酸氢二钾2gD琼脂20g一30gE蒸馏水l000mlF伊红水溶液（20g/l)20mlG美蓝水溶液（5g/L)13ml2.1.3.3.2制法将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加人乳糖，混匀后分装，以68.95kPa(115℃，10lb）高压灭菌20min。临用时加热融化琼脂，冷至50℃～55℃，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。2.1.3.4革兰氏染色液2.1.3.4.1结晶紫染色液A成分：a结晶紫1gb乙醇（95%，体积分数）20mLc草酸钱水溶液（10g/l）80mLB制法：将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸馁溶液混合。注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。2.1.3.4.2革兰氏碘液A成分：a碘1gb碘化钾2gc蒸馏水300mlB制法：将碘和碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。2.1.3.4.3脱色剂乙醇（95%，体积分数）。2.1.3.4.4沙黄复染液A成分：a沙黄0.25gb乙醇（95沉，体积分数）10mlc蒸馏水90mLB制法：将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加人蒸馏水2.1.3.4.5染色法A将培养18h一24h的培养物涂片。B将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。C滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。D滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s，水洗E滴加复染剂，复染1min，水洗，待干，镜检。2.1.4仪器2.1.4.1培养箱：36℃士1℃。2.1.4.2冰箱：0℃～4℃。2.1.4.3天平2.1.4.4显微镜。2.1.4.5平皿：直径为9cm。2.1.4.6试管2.1.4.7分度吸管：1mL,10mL。2.1.4.8锥形瓶2.1.4.9小倒管。2.1.4.10载玻片2.1.5检验步骤2.1.5.1乳糖发酵试验2.1.5.1.1取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白陈培养液中，取lml水样接种到10mL单料乳糖蛋白陈培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml（即0.1ml水样）注入到10ml单料乳糖蛋白陈培养液中，每一稀释度接种5管对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10mL水样双料培养基，每份接种10ml水样2.1.5.1.2检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.1，0.0lmL甚至0.1,0.01,0.001ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种．每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管。2.1.5.1.3将接种管置36℃士l℃培养箱内，培养24h士2h，如所有乳糖蛋白膝培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。2.1.5.2分离培养将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃土1℃培养箱内培养18h——24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落2.1.5.3证实试验经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽抱杆菌，同时接种乳糖蛋白豚培养液，置36℃士1℃培养箱中培养24h士2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在2.1.6结果报告根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN(mostProbablenumber，最可能数）检索表，报告每l00ml水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。乌管法结果见表2.15管法结果见表3稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。表2用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MPN)5个10ml管中阳性管数最可能数（MPN）02.212.225.139.2416.05162.2滤膜法2.2.1范围本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定2.2.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.2.2.1总大肠菌群滤膜法membraneriltertechniquerortotalcoliforms总大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45um的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择隆培养基上37℃培养24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。2.2.3培养基与试剂2.2.3.1品红亚硫酸钠培养基2.2.3.1.1成分：A蛋白膝10gB酵母浸膏5gC牛肉膏5gD乳糖10gE琼脂15g——20gF磷酸氢二钾3.5gG无水亚硫酸钠5gH碱性品红乙醇溶液（50g/L)20mLI蒸馏水1000mL2.2.3.1.2储备培养基的制备先将琼脂加到500ml蒸馏水中，煮沸溶解，于另500ml一蒸馏水中加人磷酸氢二钾、蛋白陈、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒人已溶解的琼脂，补足蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2一7.4，再加人乳糖，分装，68.95kPa(115℃,10lb）高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL一3mL于灭菌吸收垫上．再将滤膜置于培养垫上培养2.2.3.1.3平皿培养基的配制将上法制备的储备培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的50g/l的碱陛品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基15ml倾人已灭菌的空平皿内待冷却凝固后置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周。如培养基已由淡粉色变成深红色，则不能再用2.2.3.2乳糖蛋白膝培养液同2.1.3.