乐脉丸微生物限度检查验证方案

1乐脉丸微生物限度检查法方法学验证资料【处方】丹参998g川芎499g赤芍499g红花499g香附249.5g木香249.5g山楂124.8g【制法】以上七味，加水煎煮三次，每次1小时，加水量分别为10、8、8倍，合并煎液，滤过，滤液低温（45～50℃）浓缩至相对密度为1.10～1.30（50℃）的清膏，在80℃以下干燥，粉碎，加入适量淀粉，用90%乙醇和大豆油制软材，挤压一滚圆制丸，干燥，制成1000g，即得。【用法用量】口服，一次1～2袋，一日3次。【微生物限度检查】细菌计数按规定取本品10g，加入pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，充分分散均匀，即为1：10供试液。取1：10的供试液1ml各注2个皿，（每皿1ml），其它操作按中国药典2005年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法平皿法计数。霉菌、酵母菌计数按规定取本品10g，加入pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，用适宜的方法使充分分散均匀，即为1：10供试液，1：10供试液1ml各注2个皿（每皿1ml），其它操作按中国药典2005年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法平皿法计数。控制菌检查大肠埃希菌，检查按中国药典2005年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法规定的相应方法检查。2一、验证目的：验证乐脉丸在所设定的检验条件及程序下检验，对其中可能存在的细菌数、霉菌、酵母菌数及控制菌是否无抑制作用；以确定适宜的检验方法。二、验证范围：金鸡丸20090301、20090302、20090303三个批次三、验证条件：1、培养基：营养琼脂、虎红琼脂、胆盐乳糖培养基、MUG培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基等。以上培养基均已按规定方法灭菌。2、稀释剂：PH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（经121℃灭菌30分钟）3、仪器：天平、35～37℃的生化培养箱、30～35℃恒温培养箱(、23～28℃生化培养箱、温度计、高压灭菌器、经121℃30分钟灭菌的玻璃仪器、数显水浴恒温振荡器、医药净化工作台4、菌种：按以下方法制备成已知浓度的菌液。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉4.1接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35℃培养24小时，取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10－5～10－7，使细菌数约为150～200cfu/ml。4.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，25℃培养24小时，取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10－5～10－7，使菌数约为150～200cfu/ml。4.3接种黑曲霉的新鲜培养物至新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，25℃培养7天，加5～10ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液，取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10－4～10－6，使孢子数约为150～200cfu/ml。四、验证方法（一）细菌总数、霉菌、酵母菌总数采用平皿计数法的验证。对三批乐脉丸分别进行三次独立的平行试验。并分别计算各试验菌的回收率。1、供试品对照组取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，制成浓度为1：10供试液。用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液，按照10倍递增稀释法，制备连续2个稀释级的供试液。每一稀释度吸1ml供试液入平皿中，并注两皿作平行样，分别在每平皿中注入约15ml温度不超过45℃的营养琼脂或虎红琼脂、混匀、凝固、倒置培养。（营养琼脂板于30～35℃培养箱中培养48小时；虎红琼脂板于23～28℃生化培养箱中培养72小时），测定供试品的本底菌数。2、试验组取1：10供试液1ml和1ml各试验菌液，分别加入平皿中，立即倾注营养琼脂或3虎红琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，置培养箱中培养后测定其菌数。（用大肠埃希、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌液注皿的用不超过45℃的营养琼脂注皿，置30～35℃培养箱中培养48小时后测定其菌数；用白色念珠菌、黑曲霉菌液注皿的用不超过45℃的虎红琼脂注皿，置23～28℃培养箱中培养72小时后测定其菌数）3、菌液组不加供试液，直接取上述各菌液的量，分别依上法用琼脂培养基注皿，培养后计数，测定所加的试验菌数。4、合格标准若试验各组的菌回收率均不低于70%，该品种平皿计数法测定细菌、霉菌及酵母菌数通过验证；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。注：试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数试验组的菌回收率=-------------------------------------------------×100％菌液组的平均菌落数5、测定结果（见下表）菌种名称菌种代数菌液组试验组菌数（cfu）20090301200903022009030312均值12均值回收率（%）12均值回收率（％）12均值回收率（％）大肠埃希菌1代83858470727184.568706982.170646779.8金黄色葡萄球菌1代77737566646586.760666384.065626485.3白色念珠菌1代68646654525380.358565786.453555481.2黑曲霉1代62565950466281.448444678.050464881.4枯草芽孢杆菌1代56605844504781.043454475.840444272.2供试品组细菌数000000000霉菌及酵母菌数0000000006、结论：本品经验证试验，细菌、霉菌酵母菌计数法计数，各菌回收率均能达到70%以上，该方法适用于乐脉丸细菌数、霉菌、酵母菌数的检验。4（二）大肠埃希菌检查方法验证1、供试品对照组取1:10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基中，置35～37℃培养箱中培养18～24小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物0.2ml接种至5mlMUG培养基中，再于上述温度培养，分别于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。若MUG阳性，靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；若MUG阴性，靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；若MUG阳性，靛基质阴性或MUG阴性，靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂板上，于35～37℃培养箱中培养18～24小时。若平板无菌落生长，或生长的菌落不符合“呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽”形态特征，判未检出大肠埃希细菌。；若平板上生长的菌落与上述形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。2、试验组取1:10供试液10ml及大肠埃希菌液1ml（相当于76cfu试验菌）加入100ml胆盐乳糖培养基中，照上述供试品试验组方法操作至得出最终结果。3、阴性菌对照组取1:10供试液10ml及金黄色葡萄球菌液1ml（相当于69cfu试验菌）加入100ml胆盐乳糖培养基中，于35～37℃培养箱中培养18～24小时,挑取培养液划线接种于曙红亚甲蓝琼脂板上,再于上述温度培养24小时后观察是否检出金黄色葡萄球菌。4、阴性对照组取上述所用稀释液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，照上述供试品试验组方法操作至得出最终结果。5、合格标准：阴性对照组无菌生长、阴性菌对照组不得检出金黄色葡萄球菌。若试验组检出大肠埃希菌，该品种所采用的大肠埃希菌检查法通过验证；若试验组未检出大肠埃希菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。6、试验结果（见下表）5大肠埃希菌检查方法验证方法验证批号供试品组试验组阴性菌对照组阴性对照大肠埃希菌BL(100ml)大肠埃希菌70cfu金黄色葡萄球菌86cfuMUG-I20090301--++----20090302--++--20090303--++--曙红亚甲蓝琼脂20090301/生长典型菌落无菌生长20090302/生长典型菌落无菌生长20090303/生长典型菌落无菌生长结果20090301未检出检出未检出未检出20090302未检出检出未检出未检出20090303未检出检出未检出未检出结果试验组检出大肠埃希菌，阴性菌对照组未检出阴性菌。结论：本品经验证试验，该方法适用于乐脉丸大肠埃希菌的检验。复核人：检验人：