[NSFC]-钙敏感受体调控内源性H2S抑制糖尿病血管平滑肌细胞增殖的研究

申请代码H0217受理部门收件日期受理编号解除保护国家自然科学基金申请书(2011版)资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：项目名称：钙敏感受体调控内源性H2S抑制糖尿病血管平滑肌细胞增殖的研究申请人：电话：依托单位：通讯地址：邮政编码：单位电话：电子邮箱：申报日期：2011年2月28日国家自然科学基金委员会国家自然科学基金申请书2011版第2页版本1.017.551基本信息ykKr4oHP申请人信息姓名性别女出生年月1972年1月民族汉族学位博士职称教授每年工作时间（月）10电话电子邮箱传真国别或地区中国个人通讯地址黑龙江省哈尔滨市南岗区保健路157号工作单位哈尔滨医科大学/基础医学院主要研究领域糖尿病心血管病、心肌缺血再灌注损伤依托单位信息名称哈尔滨医科大学联系人电子邮箱电话网站地址合作研究单位信息单位名称[在此录入修改][在此录入修改]项目基本信息项目名称钙敏感受体调控内源性H2S抑制糖尿病血管平滑肌细胞增殖的研究资助类别面上项目亚类说明附注说明申请代码H0217:周围血管疾病H0713:糖尿病基地类别研究期限2012年1月—2015年12月研究属性应用基础研究申请经费70.0000万元摘要(限400字)：糖尿病血管平滑肌细胞(VSMC)增殖在动脉粥样硬化形成中起重要作用，但机制不详。VSMC通过胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）催化产生信号气体分子—H2S,后者可抑制VSMC增殖。我们研究显示，细胞内钙通过钙调蛋白与CSE的相互作用调控内源性H2S的产生，但具体的调控机制尚不清楚。本课题组已证实，钙敏感受体（CaR）作为G蛋白偶联受体可引起细胞内钙增加。在预实验中，我们发现：高糖培养72小时后，VSMC的CaR和CSE表达明显降低；激活CaR可使CSE表达上调。因此，我们推测“CaR表达下调使内质网释放Ca2+减少、CSE活性下降，导致内源H2S生成减少”是糖尿病平滑肌增殖的新机制。我们拟制备CSE敲除鼠和野生鼠的糖尿病动物模型和高糖细胞模型，应用siRNA，CSE转染、基因芯片、免疫共沉淀等技术，从整体-血管环-细胞层次证明我们的假说。此研究将为糖尿病性动脉粥样硬化的防治提供新思路和新靶点。关键词(用分号分开，最多5个)糖尿病；钙敏感受体（CaR）；胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）；H2S;血管平滑肌细胞国家自然科学基金申请书2011版第3页版本1.017.551项目组主要参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮箱项目分工每年工作时间（月）11972-6-16男副教授博士LakeheadUniversity理论指导321986-2-12女博士生硕士哈尔滨医科大学模型制备分子生物学1031974-11-17男博士生硕士哈尔滨医科大学质粒构建、转染641982-10-11女硕士生学士哈尔滨医科大学蛋白分析增值检测1051985-12-30女硕士生学士哈尔滨医科大学H2S检测细胞生物学1061957-11-3女实验师学士哈尔滨医科大学参与实验建立9789总人数高级中级初级博士后博士生硕士生72122说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申请人），总人数由各分项自动加和产生。国家自然科学基金申请书2011版第4页版本1.017.551经费申请表（金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费55.50001.科研业务费8.0000（1）测试/计算/分析费2.0000细胞周期、细胞内钙的检测（2）能源/动力费2.0000水电费（3）会议费/差旅费2.00002人参加会议的会务费和差旅费（4）出版物/文献/信息传播费2.0000发表SCI和核心期刊文章的版面费、复印费、查新费（5）其他2.实验材料费47.5000（1）原材料/试剂/药品购置费40.5000主要包括化学试剂，cDNA合成试剂，RT-PCR试剂，抗体以及各种检测试剂盒（2）其他7.0000购买实验动物3.仪器设备费0.0000（1）购置（2）试制4.实验室改装费5.协作费二.国际合作与交流费6.00001.项目组成员出国合作交流4.00001人参加国际会议的会务费及旅差费2.境外专家来华合作交流2.0000一名境外专家来华的差旅费三.劳务费5.0000直接参加项目研究的研究生、博士后人员的劳务费四.管理费3.50005%管理费合计70.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计0.0000国家自然科学基金申请书2011版第5页申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求：1、请先选定项目基本信息中的资助类别，再填写报告正文；2、在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮，通过复制/粘贴恢复）；3、请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处；4、本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据，请遵照要求填写。查看报告正文撰写提纲报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展劢态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义。附主要参考文献目录）1、项目的立项依据糖尿病(diabetesmellitus,DM)是严重危害人类健康的全身性代谢疾病,常发生血液流变学、微循环和细胞代谢的紊乱,导致缺血、缺氧和组织水肿,进而引起血管和神经病变。血管病变常常是糖尿病病人致死，致残的主要原因[1]。平滑肌细胞的增殖是糖尿病引发动脉粥样硬化性疾病的显著特征。本课题将探讨糖尿病血管平滑肌细胞增殖的可能机制，以便为糖尿病和动脉粥样硬化性疾病的防治提供新思路与新靶点。最近的研究表明，糖尿病平滑肌细胞的增殖不仅可引起血管壁的增厚和管腔的狭窄，而且通过一些级联反应最终导致动脉粥样硬化的发生（见下图1）[2]。血管平滑肌细胞增殖？小动脉管壁变厚小动脉管腔变窄、脂质堆积、斑块形成高糖ROS大量形成NO合成减少Ox-LDL增多图1高糖作用下动脉粥样硬化形成示意图血管内皮细胞血管平滑肌细胞国家自然科学基金申请书2011版第6页在正常情况下，血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）的功能以收缩为主。在高糖作用下，VSMC发生可逆性表型及其相应基因的转变，导致细胞内蛋白合成活跃，VSMC明显发生增殖而收缩功能下降[2]。在糖尿病诱发动脉粥样硬化的过程中，平滑肌细胞的增殖起关键作用。但是，糖尿病平滑肌细胞增殖的机制十分复杂，迄今尚不清楚。一般认为，糖尿病病人血管内皮细胞中eNOS的表达减少，对内源性NO的血管舒张反应消失，可能是血管平滑肌增生的重要机制之一[3]。还有在糖尿病动物模型中发现，某些生长因子如血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）和转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）等表达上调，促进平滑肌的增殖。最新研究提示，糖尿病模型中舒血管物质表达减少在调节血管平滑肌细胞表型转化及增殖中起重要作用[2,4]。继NO和CO之后，H2S（hydrogensulfide，H2S）是新发现的一种内源性气体信号分子。硫化氢具有许多与NO相似的生理功能，例如，扩血管、促凋亡和抑增殖等[5,6]。内源性H2S是机体多种细胞在半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）和半胱氨酸转移酶催化作用下产生。上述三种关键酶在体内的分布不尽相同：神经系统内主要存在CBS，而没有CSE；回肠、肝脏以及肾脏同时存在CBS和CSE；血管平滑肌则只有CSE表达而无CBS[7,8]。H2S的重要生物学效应是调节细胞的增殖和凋亡[10,11]。有研究报道，H2S参与了血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、神经细胞、胰腺腺泡细胞等的增殖和凋亡的调控[9-11]，在心血管、神经、内分泌、消化、呼吸等系统，H2S主要表现为抑制增殖。H2S对细胞凋亡的调节较复杂，例如，生理浓度H2S可抑制结肠上皮细胞的凋亡，但可诱导血管平滑肌细胞凋亡[12,13]。目前研究表明，内源性H2S广泛存在于心血管系统组织中,可调节心肌舒缩功能,舒张体循环和肺循环的血管,抑制血管平滑肌细胞增殖并调控其表型转化[12,14]。我们最先进行了内源性H2S生成调控机制的研究。2008年，本课题组的主要成员GuangdongYang发现，血管内皮细胞中游离钙增加可通过钙调蛋白（calmodulin，CaM）与CSE（H2S生成关键酶）相互作用，激活CSE，进而使H2S产生增多（Science.2008,322:587-90）[10]；2010年进一步证实，CSE的高表达可抑制平滑肌增殖和诱导凋亡，国家自然科学基金申请书2011版第7页敲除CSE基因小鼠血管平滑肌细胞则出现明显增殖[26]。钙敏感受体（calciumsensingreceptor,CaR）是G蛋白偶联受体家族中C家族成员。CaR主要分布在甲状旁腺、肾脏、胃肠道、骨组织以及其他细胞如胎盘、晶状体、乳腺、胰腺β细胞等。细胞外钙是第一个被确认的通过激活CaR而起作用的物质[15]。Ca2+既是第一信使，又起第二信使的作用，细胞外钙（第一信使）与细胞膜上的CaR结合，生成DAG（二脂酰甘油）和IP3（肌醇-1，4，5-三磷酸）。当IP3从膜上扩散到细胞浆中，与肌浆网上的IP3受体结合，引起肌浆网钙库内的Ca2+释放，使细胞内的Ca2+浓度升高（第二信使）（见图2）。CaR除了在调节机体钙稳态中起重要作用，还具有其它功能，如调节细胞增殖、分化、凋亡、激素的分泌等[16,17]。图2CaR引起细胞内钙释放的示意图（AldebarabM.HoferCellCalcium2004,35:297-307）最新研究表明，人冠状动脉和大鼠肠系膜动脉均有CaR的表达，CaR激动剂可引起肠系膜动脉舒张[18]。但是，CaR调控血管平滑肌舒缩的机制尚不清楚。在预实验中，我们发现小鼠肠系膜动脉血管平滑肌细胞中有CaR表达，激动CaR可引起细胞内钙增加。另外，我们还观察到，25mM葡萄糖作用72小时可使小鼠肠系膜动脉平滑肌细胞CaR表达明显降低（见工作基础图6）。综上所述，我们推测肠系膜动脉平滑肌细胞CaR表达下降与糖尿病阻力血管早期的细胞增殖有关。尽管国内外学者在心血管系统CaR方面开展了一些研究[19,20]，但是，CaR是否参与内源性H2S的调控迄今未见报道。新近的研究发现，细胞Ca2+调控异常参与动脉粥样硬化的平滑肌细胞增殖的发生发展[21]。我们的前期工作证实，在心肌细胞中CaR可通过激活PLC-IP3通路引起内质网释放Ca2+，进而增加细胞内钙[22,23]。此外，细胞内钙的增加，可活化CaM的活性，国家自然科学基金申请书2011版第8页其调控多种生理功能。在心血管系统中，Ca2+/CaM可调节CSE的活性，进而调控H2S的生成，最终影响血管平滑肌的张力、增殖和细胞凋亡[24,25]。基于上述分析并结合预实验结果，我们提出以下假设：糖尿病血管平滑肌CaR的表达下调，使内质网释放Ca2+减少，对CaM的活化作用减低，引起CSE活性降低，导致内源性H2S生成的减少，从而促进血管平滑肌细胞的增殖（见图3）。图3本课题假设示意图本课题拟制备CSE敲除鼠和野生鼠的糖尿病动物模型和细胞模型（高糖），应用siRNA，CSE转染、基因芯片、免疫共沉淀等技术，从整体-血管环-细胞层次证明我们的假说。本研究的顺利实施，将为糖尿病性动脉粥样硬化的防治提供新思路和新靶点。参考文献1.SoonJunHong,SungTaeKim,Tae-JinKim,Eun-OkKim,Chul-MinAhn,JaeHyoungPark,SangKim,Kyung-MiLee,Do-SunLimCellularandMolecularChangesAssociatedWith