(8)(9)细胞生物学

张岸平教授MedicaimolecularbiologyINTRACELLULARCOMPARTMENTANDPROTEINSSORTING细胞内膜系统•第一节内质网•第二节高尔基体•第三节溶酶体•第四节蛋白质的分选与运输•第五节细胞内膜系统与医学的关系第一节内质网（endoplasmicreticulum，ER）•K.R.Porter等于1945年发现于培养的小鼠成纤维细胞，因最初看到的是位于细胞质内部的网状结构，故名内质网。一、内质网的形态结构与化学组成•（一）形态结构内质网是细胞质内的连续的膜性管网状结构体系，由小管（ERtubule）、小泡（ERvesicle）、扁囊（ERlamina）。•约占细胞总膜面积的一半，是封闭的网络系统。•内质网基本类型分为粗面型内质网（roughendoplasmicreticulum，RER）滑面型内质网（smoothendoplasmicreticulum，SER）ER•（二）内质网的化学组成•1.ER膜中含大约30%~40%的脂类和60%~70%的蛋白质，脂类主要成分为磷脂，磷脂酰胆碱含量较高，鞘磷脂含量较少，没有或很少含胆固醇。微粒体:(microsome)直径100nm的封闭囊泡•内质网含有以G-6-P为主要标志酶的诸多酶系•ER约有30多种膜结合蛋白，另有30多种位于内质网腔，这些蛋白的分布具有异质性，如：葡萄糖-6-磷酸酶，普遍存在于内质网，被认为是标志酶。•核糖体结合糖蛋白（ribophorin）只分布在RER，P450酶系只分布在SER。•RER呈扁平囊状，排列整齐，有核糖体附着。•SER呈分支管状或小泡状，无核糖体附着。•细胞不含纯粹的RER或SER，它们分别是ER连续结构的一部分。二、滑面内质网的功能1.参与合成磷脂、胆固醇、甾体类激素等膜脂，合成后以出芽的方式转运至高尔基体，溶酶体和质膜上，或借磷脂转移蛋白（PTP）形成水溶性复合物，转至其他膜上。2.使葡糖6-磷酸水解，释放糖至血液中。3.解毒，如肝细胞的细胞色素P450酶系。4.储存钙离子，作为细胞内信号物质，如肌质网。5.提供酶附着的位点和机械支撑作用。1.内质网与膜脂的合成sER都能合成脂类卵磷脂的合成是在滑面内质网上合成的。原料：脂肪酸、磷酸甘油和胆碱。酶：脂酰基转移酶、磷酸酶胆碱磷酸转移酶合成部位：细胞质的胞质面C=OC=OC=OC=OC=OC=OCH2-CH-CH2PCH2-CH-CH2CH2-CH-CH2P胆碱OH3CDP-胆碱CMP2Pi细胞质基质CoAC=OC=OCoACoA++CH2-CH-CH2POHOH磷脂酸二酰基甘油磷脂酰胆碱1卵磷脂在ER膜上合成的过程脂双层腔糖原颗粒（肝细胞）滑面内质网糖原磷酸化酶葡萄糖-1-PP葡萄糖磷酸变位酶葡萄糖-6-PP葡萄糖-6-磷酸酶葡萄糖肝细胞膜血液PKAcAMP葡萄糖透性酶2.滑面内质网与糖原的代谢三、粗面ER的主要功能（一）粗面内质网上合成蛋白质的种类①外输性分泌蛋白:如抗体、激素；②膜整合蛋白（膜蛋白）：如膜抗原、膜抗体③驻留蛋白:构成细胞器的蛋白，需要进行修饰的蛋白，如溶酶体的各种水解酶；（二）信号肽引导核糖体结合于内质网膜上•1.作为核糖体附着的支架蛋白质都是在核糖体上合成的，并且起始于细胞质基质，但是有些蛋白质在合成开始不久后便转在内质网上合成。•1)信号肽（signalpeptide），位于新合成肽链的N端，一般16~30个氨基酸残基，含有6-15个连续排列的带正电荷的氨基酸，中间是疏水的中性氨基酸，C端有5~7个带负电的小分子氨基酸，信号肽酶在此切割，由于信号肽又是引导肽链进入内质网腔的一段序列，又称开始转移序列（starttransfersequence）6~156~155~7成熟蛋白质↙2)信号识别颗粒（signalrecognitionparticle，SRP,11S），由6种多肽组成，结合一个7SRNA，属于一种RNP(ribonucleoprotein)。能与信号序列结合，形成SRP-核糖体复合物，导致蛋白质合成暂停；又能识别RER膜上的SRP受体。3个功能区：翻译暂停结构域（P9/P14）信号肽识别结合位点（P54）SRP受体蛋白结合位点7SLRNA信号肽结合位点翻译暂停结构域25nmSRP受体结合位点3)SRP受体（SPRreceptor）又称停靠蛋白（dockingprotein,DP），是内质网膜的整合蛋白，异二聚体，可与SRP特异结合，它含有两个亚基，一个是暴露于细胞质的亲水性的α亚基，由640个氨基酸组成；另一个是嵌入膜内的疏水性的β亚基，由300个氨基酸组成，是G蛋白（GDP←→GTP）。4)转位因子（translocator，translocon）由3-4个Sec61蛋白构成的通道，每个Sec61由3条肽链组成，外直径约8.5nm，中心有一个直径为2nm的通道，其功能与新合成的多肽进入内质网有关。•G.Blobel等1975年提出了信号假说(Signalhypothesis)，认为蛋白质N端的信号肽，指导蛋白质转至内质网上合成，因此获1999年诺贝尔生理医学奖。•蛋白质转移到内质网合成涉及以上所讲的成分：内质网腔细胞质SRP受体信号识别颗粒(SRP)核糖体结合蛋白tRNAAP核糖体mRNA信号肽A信号假说AUGUACP位点TranslocationofsolubleproteinsacrossER信号假说的内容(P.....)：①ER转运蛋白质合成的开始，起始于游离的核糖体，mRNA决定蛋白质的去向；②信号序列与SRP结合，A位点，蛋白质合成中止；③核糖体附着到内质网上；④SRP释放与蛋白质转运通道的打开；⑤蛋白质合成重新开始，并向内质网腔转运；⑥信号肽酶切除信号序列；⑦蛋白质合成结束。细胞质ER膜ER腔分子伴侣（BiP蛋白）-ATP-ADP1.5nm-ATP5nm-ADP1.5nmADP（三）跨膜蛋白的插入与转移1.新生肽链的协同翻译机制协同翻译(co-translation)肽链边合成边向内质网腔转移的方式。（1）起始转移信号（信号肽）：切除或不切除（2）内部信号序列：不被切除）（3）停止转移序列（stoptransfersequence）与内质网膜的亲合力很高，阻止肽链继续进入内网腔，成为跨膜蛋白。②2.单次跨膜蛋白质的转移插入3.多次跨膜蛋白质的转移插入InsertionofaMultipassTransmembraneproteinintotheERmembrane（四）.新生肽链的折叠、组装和运输•COPII介导由内质网输出的膜泡运输，这种膜泡由内质网的排出位点（exitsites）以出芽的方式排出。•不同的蛋白质在内质网腔中停留的时间不同，这主要取决于蛋白质完成正确折叠和组装的时间，这一过程是在属于hsp70家族的ATP酶的作用下完成的，需要消耗能量。•分子伴侣(molecularchaperone):是一类与其他蛋白质的不稳定构象相结合并使之稳定的蛋白质，他们通过控制结合和释放来帮助被结合多肽在细胞内进行折叠、组装、转运或降解等。ADP+PiATP•有些无法完成正确折叠的蛋白质被输出内质网，转入溶酶体中降解掉，大约90%的新合成的T细胞受体亚单位和乙酰胆碱受体都被降解掉，而从未到达靶细胞膜。BIP蛋白在内质网中的两个作用：Ⅰ.BIP同进入内质网的未折叠蛋白的疏水氨基酸结合，防止多肽链不正确地折叠和聚合。Ⅱ.防止新合成的蛋白质在转运过程中变性或断裂。驻留信号：Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）（五）.蛋白质的修饰与加工•包括糖基化、羟基化、酰基化、二硫键形成等，其中最主要的是糖基化，几乎所有内质网上合成的蛋白质最终被糖基化。•糖基化的作用：–①使蛋白质能够抵抗消化酶的作用；–②赋予蛋白质传导信号的功能；–③某些蛋白只有在糖基化之后才能正确折叠。•糖基一般连接在4种氨基酸上，分为2种：–O-连接的糖基化（O-linkedlycosylation）：与Ser、Thr和Hyp的OH连接，连接的糖为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，在高尔基体上进行。–N-连接的糖基化（N-linkedlycosylation）：与天冬酰胺残基的NH2连接，糖为N-乙酰葡糖胺,在内质网上进行。•内质网上进行N-连接的糖基化。糖的供体为核苷糖，如CMP-唾液酸、GDP-甘露糖、UDP-N-乙酰葡糖胺。•糖分子首先被糖基转移酶转移到膜上的磷酸多萜醇（磷酸长醇dolicholphosphate）分子上，装配成寡糖链。•再被寡糖转移酶转到新合成肽链特定的三肽序列（Asn-X-Ser或Asn-X-Thr）的天冬酰胺残基上。ProteinglycosylationinRER2个N-乙酰葡萄糖胺9个甘露糖3个葡萄糖第二节高尔基复合体•最早发现于1855年，1889年，Golgi用银染法，在猫头鹰的脊髓神经节细胞内观察到了清晰的结构，定名为高尔基体。20世纪50年代以后才正确认识它的存在和结构。•（一）是由三种不同大小类型的囊泡形成的有极性的膜性细胞器。•1.扁平囊泡直径约1um，单层膜构成，中间为囊腔，周缘多呈泡状，3~8个扁平囊层叠在一起(某些藻类可达一二十个)，构成高尔基体的主体(Golgistack)。一、具有极性的膜性细胞器形态与组成TheGolgiApparatus•常分布于内质网与细胞膜之间，呈弓形或半球形。•2.小囊泡（运输小泡)：凸出的一面对着内质网称为形成面或顺面（cisface）。•3.大囊泡（分泌泡）：凹进的一面对着质膜称为成熟面或反面（transface）。顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡。（二）高尔基体复合体的功能区隔1.高尔基体顺面的网络结构（cisGolginetwork，CGN），是高尔基体的入口区域。2.高尔基体中间膜囊（medialGolgi），多数糖基修饰，糖脂的形成以及与高尔基体有关的糖合成均发生此处。3.高尔基体反面的网络结构（transGolginetwork，TGN），是高尔基体的出口区域，功能是参与蛋白质的分类与包装，最后输出。（一）脂类是高尔基复合体结构的最基本化学组分•高尔基体膜含有大约40%的脂类和60%的蛋白，具有一些和ER共同的蛋白成分。膜脂中磷脂酰胆碱的含量介于ER和质膜之间，中性脂类主要包括胆固醇，胆固醇酯和甘油三酯。二、高尔基复合体的基本组分和特征（二）糖基转移酶是高尔基复合体中最具有特征性的标志酶•高尔基体中的酶主要有糖基转移酶、磺基-糖基转移酶、氧化还原酶、磷酸酶、蛋白激酶、甘露糖苷酶、转移酶和磷脂酶等不同的类型。三、高尔基复合体主要功能•1、参与细胞分泌活动•RER上合成蛋白质→进入ER腔→COPII运输泡→进入CGN→在medialGdgi中加工→在TGN形成运输泡→运输与质膜融合、排出。•高尔基体对蛋白质的分类，依据的是蛋白质上的信号肽或信号斑。3H标记亮氨酸3分钟17分钟117分钟高尔基复合体在分泌颗粒的形成过程中起着浓缩、修饰、加工等作用。分泌蛋白的加工修饰•2、蛋白质的糖基化•O-连接的糖基化主要在高尔基复合体中进行，糖的供体为核苷糖。N-连接的寡糖链：起始在rER腔，最终完成在高尔基复合体。O-连接的寡糖链：主要在高尔基复合体内合成。糖蛋白①高甘露糖②复杂型糖蛋白的加工和修饰3H标记甘露糖3H标记半乳糖；唾液糖3H标记N-乙酰葡萄糖胺②.复杂型：保留2个N-乙酰葡萄糖胺，3个甘露糖，加上2个GlcNac,2个半乳糖（或岩藻糖），2个唾液酸高尔基复合体对糖蛋白的合成和修饰过程具有严格的顺序性。3、进行膜的转化功能内质网上合成的新膜脂转移至高尔基体后，经过修饰和加工，形成运输泡与质膜融合。4、将蛋白水解为活性物质如将蛋白质N端或C端切除，成为有活性的物质，如胰岛素（C端）；或将含有多个相同氨基序列的前体水解为有活性的多肽，如神经肽。5、参与形成溶酶体。6、参与植物细胞壁的形成，合成纤维素和果胶质。胰岛素有生物活性的物质（激素）前胰岛素原（无活性的前体物质，某些肽类激素）4.图参与蛋白质的加工改造切去C肽ssssABC胰岛素原（由A、B、C三段