三种荧光定量PCR检测方法比较

三种荧光定量PCR检测方法比较定量pcr：以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：(1)SYBRGreenI检测模式SYBRGreenI是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。PCR扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。SYBRGreenI的缺点：由于SYBRGreenI没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。SYBRGreenI的优点：SYBRGreenI的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。(2)水解探针模式(taqman探针)TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此Taqman探针检测的是积累荧光。PCR扩增程序通常是：94℃～60℃40个循环。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。(3)杂交探针模式(Beacon、FRET)分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补;茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团：FAM，TexasRed。PCR扩增程序通常是：94～55～72℃三步法，40个循环。FRET探针又称双杂交探针，FRET探针由两条相邻探针组成，在一条探针的5`端标记FAM荧光基团，另一探针的3`端标记Red640荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM基团和Red640基团相邻，激发FAM产生的荧光，作为Red640基团的激发光被吸收，使Red640发出波长为640的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640波长的荧光。由于FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非累积信号。常用的荧光基团是：LC-Red640，LC-Red705。能用于实时荧光PCR定量的方法很多，各有优缺点，应根据实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方法。下面为各种方法的比较：实验中的一些好习惯：加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均;移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。一定要记着关水浴箱，切记切记;多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了;所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因。防止RNA酶污染的措施：1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用)。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。常用的RNA酶抑制剂：1.焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理动植物总RNA提取-Trizol法：Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。1.将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。2.研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。3.取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。4.弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。5.小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。[注意]1.整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值2.加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。总mRNA的提取经验：一、关于TrizolReagent需要的试剂1.Chloroform：氯仿(分析纯)2.Isoproplylalcohol：异丙醇(分析纯)3.75%Ethanol(inDEPC-treatedwater)：75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。4.RNase-freewater：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%(V/V)加在dH2O中500ml(50ul)，在37℃过夜，并高压灭菌即得(150℃3小时)5.一次性塑料手套6.注意：DEPC有致癌之嫌二、关于TrizolReagent的使用过程：1.Homogenization(匀浆)a.Tissues：组织每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。b.CellsGrowninmonolayer(单层细胞接毒后出现病变的)针对JEV细胞总RNA的抽提法：BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml(采用大瓶)，37℃吸附1h，倒掉，加维持液(含2%的血清和HEPE8的MEM)约5ml，维持天。出现75%-100%的病变时，以PBS(预冷)冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞(细胞瓶有两种常用规格：大的约45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致DNA的污染)具体方法如下：(样品一定要新鲜)(1)组织接入预冷的EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2(量一定要加足，否则易污染)，混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物彻底分离。(2)加氯仿0.2ml(每1mlTrizol试剂加入氯仿0.2ml)，盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟。(3)4℃离心，10000g×15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。(4)仔细吸取上层水相，移至另一EP管中。(5)加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA(每1mlTrizol试剂加入0.5ml异丙醇)，置室温10min。(6)4℃离心，10000g×10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。(7)弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml(每1mlTrizol试剂加入75%乙醇至少1ml)，震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，5500g×5min。弃上清液，空气干燥(或真空干燥)后，沉淀重悬于无RnasedH2O中，吹吸几次，55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA，-70℃保存备用。(8)抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280ratio1.6。(9)分离组织10mg(纯组织)加800ulTrizol试剂。(10)扩增产物的鉴定。DEPC处理方法如下：1.DEPC处理：(1)DEPC水：100ml超纯水加入0.2mlDEPC，充分混匀，高压灭菌。(2)Tip头(枪头)、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材(包括1ml、200μl、20μlTip头;EP管和PCR反应管等)：用0.1%的DEPC水(1000ml超纯水加入1mlDEPC)37℃浸泡过夜，高压灭菌。2.提取RNA，用DEPC水溶解。3.RT：我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。4.操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1%DEPC水，在灭菌就行了;现在有进口的RNASEFREE的枪头买，直接用不用处理的。如何消除污染：机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。(1)试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。(2)加样：原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，