上海交通大学微生物实验课件实验五细菌的快速生化鉴定及水中大肠菌群的测定2.

实验五细菌的快速生化鉴定水中总大肠菌群的测定细菌芽孢染色目的要求了解多项微量简易鉴测技术的原理及其应用上的优越性理解快速鉴定卡API20E原理和运用上的优越性，掌握操作技术和结果判定掌握IMViC原理和在细菌鉴定中的意义掌握水中总大肠菌群的测定了解芽孢杆菌的形态特征IMViC原理p117用来鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，表示水质受粪便污染的程度I:吲哚试验，细菌分解色氨酸产生吲哚，与指示剂对二甲基氨基苯甲酸，形成红色产物M：甲基红试验，细菌利用葡萄糖产生酸的能力，大肠杆菌发酵葡萄糖，维持酸性pH4，显示红色，产气肠杆菌将有机酸转化为非酸性末端产物，使pH6，颜色保持不变。V：V-P试验，测定细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端的产物的能力，丙酮酸缩合脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被氧化称二乙酰，二乙酰与蛋白中的精氨酸胍基作用，生成红色化合物，即为阳性。C：柠檬酸盐，检测细菌利用柠檬酸盐的能力，细菌分解柠檬酸盐产生碱性化合物，使pH升高，加入1％的溴麝香草酚蓝指示剂，培养基由绿色转变为深蓝色。大肠杆菌：产气肠杆菌：V.P.试验阳性甲基红试验阴性V.P.试验阴性甲基红试验阳性（“微生物学实验”P118）一、多项微量简易鉴测技术p120一次试验就能检测多项反应，或几十项反应，使微生物能很快地、简易地被鉴定，这种技术称为多项微量简易鉴测技术，或数码分类鉴定法。基本原理针对微生物的生理生化特性，配制各种培养基、反应底物、试剂等，分别微量地(约0．1m1)加入各个分隔室中,各分隔室在同一塑料条或板上构成检测卡。试验时加入待检测的某一种菌液，培养2～48h，观察鉴定卡上各项反应，按判定表判定试验结果，用此结果编码，查检索表(根据数码分类鉴定的原理编制成)判断检测微生物的鉴定结果，或用电脑判断(软件也是根据数码分类鉴定的原理编制)，打印出检测微生物的鉴定结果。API20E鉴定卡该系统鉴定卡是一块有20个分隔室的塑料条，分隔室由小管组成，各小管中含不同的脱水培养基、试剂，或底物等，每一隔室可进行一种生化反应，主要鉴定肠杆菌科（Enterobacteriaceae)细菌。APIStrep：鉴定革兰氏阳性菌操作步骤1．将待检验的菌落用生理盐水（短试管）配制成菌悬液，混合均匀（2个人一组）。2.首先测定氧化酶实验，取一环菌落于滤纸上，然后滴一滴1％四甲基对苯二胺试剂，观察颜色的变化，如出现深棕色为阳性。3．将API20E鉴定卡的密封膜拆除，在卡上标明检验菌号、日期和试检者。4．用无菌毛细管吸配制好的菌液，沿分隔室的小管内壁稍微倾斜地缓缓加入小管中约2/3处，有一横线的最后要加液体石蜡。5．将接种的鉴定卡放入装有少量水的塑料盒或浅瓷盘中(防止反应液蒸发)，置37℃孵育。6．孵育18～24h，在需要添加试剂的小杯中加入指定的试剂，如IND反应加入IND试剂，V．P．反应加入V．P．试剂，TDA反应加入TDA试剂。观察鉴定卡上各项反应的变色情况，根据反应判定表(p124表)，判定各项反应是阳性或阴性反应。7.按鉴定卡上反应项目的顺序，每三个反应项目编为一组，共编为七组，每组中每个反应项目定为一个数值，依次是l、2、4，各组中反应阳性者记“+”，则写下其所定的数值，反应阴性者记“一”，则写为0，每组中的数值相加，便是该组的编码数，这样便形成了7位数字的编码，见表ⅪⅢ一2举例说明。8．用7位数字的编码查检索表，或输入电脑检索，则能将检验的细菌鉴定是什么菌种。实验结果37°C培养24小时（明天中午12点－1点），观察结果，滴加试剂，记录各项反应是阴性还是阳性，根据实验结果获得的7位编码数值，查询检索表，获得鉴定结果水中总大肠菌群的测定总大肠菌群：是一类无芽孢、需氧或兼性厌氧、革兰氏阴性、37°C培养24-48小时,发酵乳糖产酸产气的一类细菌，包括埃希氏属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、和柠檬酸杆菌属。总大肠菌群可以作为水质的卫生检测指标，每升水大肠菌群小于3个。饮用水的卫生指标：细菌总数和总大肠菌群多管发酵法：初发酵、平板分离、复发酵乳糖胆盐发酵管含有蛋白胨、溴甲酚紫、胆盐、乳糖，用于水中、食品中、化妆品中总大肠菌群的测定。内置有倒置的德汉氏小管，可判定是否产气伊红美兰培养基（EMB）乳糖，伊红和美兰（抑制阳性菌），弱选择性，发酵乳糖产生的酸使两种染料结合成复合物，产生带金属光泽的菌落完整的操作步骤p209水样的稀释：10倍倍比递减稀释，作3个稀释度(原液、1：10、1：100）（长试管含9mL无菌水），每个稀释度各取1ml接种到乳糖胆盐发酵管，平行接种3个试管，每组接种9个试管（4人一组）37°C培养24小时，未产气者，继续培养48小时记录发酵的管数产酸产气的发酵管再接种伊红美兰培养基，观察菌落颜色，并进行革兰氏染色革兰氏阴性、无芽孢的菌落再次接种乳糖胆盐发酵管，产酸产气的为阳性芽孢染色法基本原理由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，用着色力强的染色剂孔雀绿在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。操作步骤制备菌悬液:玻片上加1－2滴水,挑取菌苔,混匀制成菌悬液染色:加2－3滴孔雀绿染液与菌液混匀,火焰加热煮沸，期间添加孔雀绿染液2－3次.冷却后水洗复染:番红染液染3min,倾去染液,水洗，吸干镜检:油镜观察实验报告实验目的实验原理实验步骤实验结果实验体会思考题p120(2、3)、p125(1、2)、p212(1、2、3)下次实验细菌的药敏试验（p89）和水中大肠菌群的测定（p204）