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1实验一牛奶中酪蛋白的制备一、实验目的1.学习从牛乳中制备酪蛋白的方法。2.了解从牛奶中制取酪蛋白的原理。二、实验原理牛乳中的主要蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5g/100ml。酪蛋白是含磷蛋白质的混合物，相对密度1.25-1.31，不溶于水、醇、有机溶剂，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH值调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯的酪蛋白。三、原料与器材鲜牛奶、恒温水浴锅、台式离心机、抽滤装置。四、试剂1.95%乙醇2.无水乙醚3.0.2mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液A液（0.2mol/l的醋酸-醋酸钠溶液）：称取NaAc.3H2O54.44g，定容至2000ml。B液（0.2mol/l的醋酸-醋酸钠溶液）：称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g，定容至1000ml。取A液1770ml与B液1230ml混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000ml。4.乙醇-乙醚混合液乙醇：乙醚=1：1（体积比）。五、操作步骤1.将5ml牛奶置试管或小烧杯中，在水浴中加热至40℃，在搅拌下漫漫加入预热至40℃（应注意两种液体都应先预热至40℃再用），pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液5ml，用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7(用1%NaOH或10%醋酸溶液进行调整)。观察牛奶开始有絮状沉淀出现后，保温一定时间使沉淀完全。将上述悬浮液冷却至室温。离心分离8min（8000r/min）或15min（2000r/min），弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。2.用蒸馏水洗涤沉淀3次（洗涤时将沉淀颗粒用干净吸管吹开或用毛细管的封闭一端搅开，充分洗涤），离心5min（12000r/min）或10min（3000r/min），弃去上2清液。3.在沉淀中加入3ml95%的乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次，最后用乙醚洗涤沉淀2次，抽干。4.将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白精制品。5.称取所获酪蛋白的质量（g）。六、计算含量和得率：酪蛋白含量（g/ml）=酪蛋白（g）/5ml×100%；得率=测得含量/理论含量×100%。七、实验注意事项：1.离心管中装入样品后必须严格配平，否则对离心机损坏严重；2.离心管装入样品后必须盖严，并擦干表面的水分和污物后方可放入离心机。3.离心机用完后应拔下电源，然后检查离心腔中有无水迹和污物，擦除干净后才能盖上盖子放好保存，以免生锈和损坏。八、思考题：1.为什么调整溶液的pH可以将酪蛋白沉淀出来？2.试设计一个利用蛋白质其他性质提取蛋白质的实验。3实验二、双水相萃取相图的绘制及BSA分配系数的测定一、实验目的1.掌握绘制双水相相图的方法2.理解双水相形成条件和定量关系3.掌握PEG/无机盐体系双水相萃取蛋白质的方法4.了解影响蛋白质在双水相体系中分配行为的主要参数二、实验原理双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。双水相形成条件和定量关系常用相图来表示（见图1）。成相物质都能与水无限混合，当它们的组成位于曲线的上方时（用M点表示）体系就会分成两相，分别有不同的组成密度，轻相（或称上相）组成用T点表示，重相（或称下相）组成用B点表示，T、B点称为节点。直线TMB称为系线，是相图的重要特征，关系到相的平衡组成。所有组成在系线上的点，分成两相后，其上下相组成均分别为T、B，但是其体积比（VT/VB）不同。相体积比可由相图上线段比（BM/MT）估算，即服从杠杆规则。本实验绘制PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。图1双水相体系相图与一般分离纯化技术相比，双水相萃取技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点，在蛋白质等生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术。影响蛋白质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH值等。三、实验材料及仪器PEG1000原液（0.6g/mL，w/w=56.926%，密度1.054）；硫酸铵原液（0.43g/mL，密度1.2）。牛血清白蛋白标准液（100μg/mL，pH8.0）；4考马斯亮蓝G-250蛋白试剂。紫外可见分光光度计。四、实验方法1、双水相相图的绘制准确称取2.0mLPEG原液，加入25mL具塞刻度试管中，然后逐滴加入硫酸铵原液，混合，直至试管中开始出现混浊为止，记录加入硫酸铵量，算出PEG和硫酸铵在系统中的质量百分浓度，再向试管中加入适量水（0.2~0.5~1.0mL），使体系变澄清，记录加入水的量，并继续加入硫酸铵，使体系再次变混浊，如此反复操作二十几次，计算达到混浊时PEG和硫酸铵在系统中的质量百分含量，得出不同相对分子量的PEG和硫酸铵的双节线相图节点。以上述试验所得结点绘制出不同相对分子量的PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。2、标准曲线的绘制：按下表加入试剂。摇匀。放置2min后测定595nm吸光度值。管号1（空白）234567BSA标准液（mL）00.10.20.40.60.81蒸馏水（mL）1.00.90.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250试剂（mL）5555555蛋白质量（μg）01020406080100OD5953、双水相萃取BSA蛋白取4mLPEG储液和4mL硫酸铵溶液于干燥的10mL刻度试管中，再加入1mL牛血清白蛋白溶液，混匀，以少量蒸馏水调节体系总质量为10g，混匀，静置15min，读取上下相体积及总体积，再将其倒入分液漏斗使上下相分开，并分别测上下相蛋白浓度。五、数据处理1、双水相相图的绘制表1相图节点数据序号PEG质量（g）体系中盐溶液（mL）盐质量（g）体系加水量（g）体系总质量（g）PEG质量分数（w/w）盐质量分数（w/w）1020.330.5……………………n1.5根据数据结果绘制双水相相图2、标准曲线的绘制：以蛋白量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘出标准曲线。53、牛血清白蛋白分配系数有关计算公式：分配系数m=Ct/Cb,相比R=Vt/Vb，萃取率Y=目标相中的蛋白量/上下相中的总蛋白量。五.思考题1、如何利用双水相相图控制相比？2、PEG平均分子量及浓度、(NH4)2SO4浓度、pH值等因素如何影响双水相体系中被提纯物质的分配平衡？6实验三、离子交换柱层析法分离氨基酸一.实验目的1.学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。2.掌握离子交换柱层析的基本操作。3.掌握氨基酸和茚三酮显色机理。二.实验原理1．离子交换层析法离子交换层析法（简称ICE）是分离和制备样品混合物的液-固相层析方法。用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。即溶液中的离子同离子交换剂上功能集团交换反应的过程。这种可逆地交换性质是基于待测物质的阳离子或阴离子和相应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质的酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附原理将电解质溶液各组分分开。它是从复杂混合物体系中分离性质极为相似的生物分子的有效手段之一。层析时要根据物质的解离性质的差异，选用不同的离子交换剂进行分离。由于带电荷不同的各种物质对离子交换剂有不同的亲和力，通过改变洗脱液的离子强度和pH值，控制这种亲和力，即可使这些物质根据亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。2．氨基酸的性质氨基酸是两性电解质，分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，各种氨因为亲和力不同，在洗提过程中，不同离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得以分离。带电荷量少，与交换剂亲和力小的先被洗脱下来；带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来7基酸分子结构不同，在同一pH值是所带的电荷的性质和多少不同，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可以根据亲和力从小到大的顺序被洗脱液分别洗脱下来，达到分离的效果。R-SO3H+M+===R-SO3M+H+R-NH3OH+Cl-===R-NH3Cl+OH-3．茚三酮反应茚三酮反应是在加热条件及弱酸环境下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫蓝色（与脯氨酸或羟脯氨酸反应生成(亮)黄色）化合物及相应的醛和二氧化碳的反应。三.实验器材层析柱1.0cmx20cm；恒流泵；部分收集器；试管；烧杯；移液枪；电磁炉；水浴锅；分光光度计四.实验试剂732型阳离子交换树脂；洗脱液(0.45mol/L，pH5.3的柠檬酸钠缓冲溶液)；显色剂(2%茚三酮)；60%乙醇；混合氨基酸样品液0.005mol/L(Asp、Lys)五.实验步骤1.树脂的处理（已做好）新鲜树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。用4倍提及的2mol/LHCl浸泡1h，倾去清液，用蒸馏水水洗至中性。再用2mol/LNaOH浸泡1h，用蒸馏水洗去NaOH至树脂pH呈中性，最后用pH5.3柠檬酸钠缓冲液浸泡，备用。（实验中这一部老师已经做好，可以直接使用浸泡好的树脂。）氨基酸名称α-COOHpKaα-NH3+pKaRgrouppKaAsp2.19.83.9Lys2.29.010.582.装柱前准备选择层析柱（1x20cm），观察柱底端滤膜是否完好，分别用流水和蒸馏水冲洗干净。将层析柱垂直装在铁架台上，柱进水口和出水口装上橡皮管，关闭柱底端出口，在柱内注入少许（约1.0cm高）洗脱液，打开出水口，排净管内的空气后关闭出水口。3.装柱向盛有已处理好的树脂的烧杯中，加适量洗脱液，用玻棒轻轻将树脂搅成悬浮状。然后沿柱内壁小心地加至适当高度。倒入速度不要太快，以防产生泡沫和气泡。待树脂在柱底部有明显沉积后，慢慢打开柱底端的出口，或用吸管吸去柱内上层过多的洗脱液，继续向柱内加入悬浮的树脂直至沉积后柱床体高度达6.0cm为止，液面高度为3-4cm。4.平衡层析柱装好后，接上已调好流速的恒流泵，用洗脱液以0.4ml/min的流速进行平衡，直至流出液的pH值与洗脱液的pH值相同为止（2-3倍柱床体积，约20min）。5.加样移去层析柱上端出口塞，打开层析柱底端出口，小心使层析柱内液体流至层析柱床体表面时，立即关闭出口。用微量取液器吸取0.5ml氨基酸混合样液沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面。加样完毕后，慢慢打开层析柱底端出口，使液面流至与树脂表面相平时，即行关闭。用移液枪吸取0.5ml洗脱液，重复上样方法反复洗涤层析柱内壁四周2-3次，当最后一次洗脱液面流至与树脂表面相平时立即关闭柱底端出口。6.洗脱与收集用滴管吸取洗脱液，沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面。加至约3-4cm高后，接上层析柱上端出口塞，同时打开层析柱底端出口和已调好流速的恒流泵开关，开始进行自动洗脱并计时。以每管4.0ml的条件进行收集（10min/管，准确计时），收集10管后关闭恒流泵停止收集（试管收集前应事先编号）。7.样液的测定按下表所示配制待测溶液，用分光光度计测其在570nm下的吸光度。0123456789109收集的样液0.00.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5洗脱液1.51.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0茚三酮0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5100摄氏度保温25min，冷却至室温60%乙醇3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0然后以吸光度为纵坐标，洗脱液累计体积（每管4ml，故4ml为一个单位）为横坐标绘制洗脱曲线，并加以说明。六.注意事项层析柱底端滤膜要完好，防止树脂进入导管后堵塞导管。倒入速度不要太快，以防产生泡沫和气泡。装柱的注意事项装柱时应注意液面不能低于数值表面。树脂悬浮液的温度要相对恒定或应与室温接近，否则柱床体内易产生气泡而影响层析效果。装好的柱体应该没有“纹路”、节痕和气泡，并且柱床体表面平整而均匀。否则需要重新装柱直至达到要求为止。在装柱的同时应该将其他仪器设备（如：自动部分收集器，恒流