不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冻存和复苏的影响

不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冻存和复苏的影响(1.广东广州510631；2.华南师范大学生命科学学院2011级生物科学2班)摘要：以小鼠胎儿的成纤维细胞为实验材料,以不同冷冻保护剂（10%DMSO、10%EG、10%GL、5%DMSO+5%EG、5%DMSO+5%GL）和不同浓度的血清（10%、20%、30%）组合,冻存和复苏小鼠胎儿成纤维细胞,观察贴壁情况和测定细胞存活率,以研究不同冷冻保护液对小鼠胎儿成纤维冻存和复苏.实验结果表明:①同一冷冻保护剂剂对细胞的冷冻保护效果随着血清浓度的增加而增强（10%GL除外）;②5%DMSO+5%EG+30%FCS的冷冻保护效果最好.关键词：冷冻保护剂；血清浓度；冷冻保存；成纤维细胞；生理特性1引言成纤维细胞具有较强的分裂增生能力，适应性强且性状稳定，是研究动物克隆最常用的细胞类型。对于ES细胞的分离和克隆而言,成纤维细胞冷冻保存能随时提供饲养层而不受胎儿、睾丸或其它实验材料不足的限制［1］。但是，体外培养的细胞，随着传代次数的增加，细胞各种生物学特征会逐渐发生变化，同时，长期传代也会造成资源浪费。细胞冷冻在超低温(-196℃)环境之下,其代谢活动几乎停止,解冻复苏之后又能恢复正常的生理活动。因此，在细胞传代过程中，需要适时进行细胞冷冻保存，以保证体外培养细胞的质量，又便于取用。细胞若在不加低温保护剂而直接进行冻存，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞发生一系列的变化，如机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等等，最终导致死亡。因此需要使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。常用的冷冻保护剂主要包括二甲亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、甘油（GL)。使用不同冷冻保护剂，冻存和复苏效果存在差异，因此探究不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冻存和复苏的影响，以便于更好保存细胞，具有重大意义。2材料与方法2.1材料与仪器材料：对数生长期的小白鼠成纤维细胞试剂：消化液；洗涤液；培养液；0.4%台盼兰；冷冻保护剂（10%DMSO、10%GL、10%EG、5%DMSO+GL、5%DMSO+GL）10%、20%、30%FCS.器具：超净工作台、CO2培养箱、离心机、废液缸、倒置显微镜、低温冰箱、酒精灯、吸管、移液枪、泡沫小盒、搪瓷罐、离心管、细胞冻存管、血细胞计数板2.2实验方法2.2.1细胞冷冻保存取出对数生长期的小白鼠成纤维细胞，吸去培养液；加入消化液2~3ml，消化2~5min后去除消化液，加入洗涤液约5ml，吹打、分散细胞；平衡后，放入离心机离心5min(2500r/min)，弃去上清液，加入冷冻保护剂2ml，吹散细胞；分装入冷冻管，做好标签，用棉花包裹好冷冻管，放至泡沫小盒，放入-70℃超低温冰箱保存。2.2.2细胞复苏用长镊从超低温冰箱中取出细胞冻存管，立即投入盛有38℃温水的搪瓷灌或不锈钢杯内，盖上盖并不时摇动，尽快解冻；从37℃水浴中取出冻存管，用酒精或酒精棉球消毒后，打开螺帽，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并洗涤液至10ml，混合后2500转/min离心5min，弃上清；细胞沉淀中加入培养液5－6ml，置37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，观察细胞生长情况。2.2.3细胞活力测定和计数在1.5mlEP管中将100μL细胞悬液与100μL0.4%台盼兰溶液混合，染色2-3分钟；将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上；加样前，先将细胞悬液充分混合均匀，吸出少许（10μL),滴加在盖玻片与计数室平台交界处，利用毛细作用将样液吸入计数室。镜下观察，死细胞被染成蓝色，活细胞呈无色透明状。计算计数板上四个大格细胞的死细胞和活细胞数，计算细胞浓度和存活率。细胞存活率（%）=（活细胞数/总细胞数）×100%细胞浓度（个/ml）=（4大格细胞数之和/4）×104×23结果与分析3.1不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻效果的影响在同一血清浓度下，以10%DMSO、10%EG、10%GL、5%DMSO+5%EG、5%DMSO+5%GL作为冷冻保护剂冻存小鼠胎儿成纤维细胞，复苏后观察贴壁情况，测定细胞存活率。由表1（横向比较）和图1（10%FCS为蓝色条柱，20%FCS为紫色条柱，30%FCS为黄色条柱）可见：当血清浓度为10%时，10%DMSO、10%EG、10%GL、5%DMSO+5%EG、5%DMSO+5%GL五种冷冻保护剂的细胞存活率由大到小为：5%DMSO+5%EG(69.71%)10%EG(66.89%)10%DMSO(58.63%)5%DMSO+5%GL(55.30%)10%GL(53.05%),其中5%DMSO+5%EG的冷冻保护效果最好，细胞存活率显著高于10%DMSO、5%DMSO+5%GL和10%GL（P0.05)，略高于10%EG但无显著差异；当血清浓度为20%时，五种冷冻保护剂的细胞存活率由大到小为：5%DMSO+5%EG（73.66%）10%EG(68.11%)5%DMSO+5%GL(67.66%)10%DMSO(61.33%)10%GL(58.10%),其中5%DMSO+5%EG的冷冻保护效果最好，细胞存活率显著高于10%DMSO、10%GL，也高于10%EG，5%DMSO+5%5%GL，但差异不显著；当血清浓度为30%时，五种冷冻保护剂的细胞存活率由大到小为：5%DMSO+5%EG（82.68%）10%EG(76.02%)5%DMSO+5%GL(74.39%)10%DMSO(71.23%)10%GL(28.87%)，其中5%DMSO+5%EG的冷冻保护效果最好，细胞存活率显著高于10%DMSO、10%GL，也高于10%EG，5%DMSO+5%5%GL，但差异不显著，10%GL的冷冻保护效果最差，仅为28.87%，显著低于其他四种冷冻保护剂。由表2可见，除了30%FCS+10%GL，无论是在哪一种血清浓度下，五种冷冻保护剂冻存小鼠胎儿成纤维细胞，复苏后，细胞基本都能贴壁，说明细胞在冻存后活性基本没有改变。综上所述，无论在哪一种血清浓度下，5%DMSO+5%EG的冷冻保护效果都是最好，10%EG次之，10%GL最差。3.2血清浓度对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻效果的影响由图1可以清晰地看出，同一冷冻保护剂，随着添加的血清浓度的增加，小鼠胎儿成纤维细胞复苏后的存活率呈上升趋势（10%GL除外），即对细胞的冷冻保护效果增强。由表1可见：①冷冻保护剂为10%DMSO时，冷冻保护效果随着血清浓度的增加而增加，但仅30%FCS和10%FCS之间达到了显著差异；②冷冻保护为10%EG，三种血清浓度的细胞存活率由大到小30%FCS20%FCS10%FCS,但三者之间差异不显著；③冷冻保护剂为10%GL，三种血清浓度下的细胞存活率由大到小为20%FCS10%FCS30%FCS,其中30%FCS的细胞存活率显著低于其余两种血清浓度；④冷冻保护剂为5%DMSO+5%EG时，冷冻保护效果随着血清浓度的增加而增加，但仅30%FCS和10%FCS之间达到了显著差异；⑤冷冻保护剂为5%DMSO+5%GL时，冷冻保护效果随着血清浓度的增加而增加，但仅30%FCS和10%FCS之间达到了显著差异。由表2可见，除了30%FCS+10%GL，无论是哪一种冷冻保护剂，不同的血清浓度下冻存小鼠胎儿成纤维细胞，复苏后，细胞基本都能贴壁，说明细胞在冻存后活性基本没有改变。综上所述，同一冷冻保护剂剂对细胞的冷冻保护效果随着血清浓度的增增加而增强（10%GL除外）。3.2最佳冷冻保护组合由表1和图2，可以清晰地看出，5%DMSO+5%EG+30%FCS的冷冻保护下，小鼠胎儿成纤维细胞的存活率最高，达到了82.28%，说明5%DMSO+5%EG+30%FCS的冷冻保护效果最好，但用SPSS13.0分析软件对15种冷冻剂组合的冷冻保护效果进行多重比较，其与10%EG+30%FCS、5%DMSO+5%GL+30%FCS，5%DMSO+5%EG+20%FCS，并无显著性差异，因此在实验中为了节约成本，简化操作程序可选用10%EG+30%FCS代替。表1：不同冷冻保护剂和血清浓度对小鼠胎儿成纤维细胞复苏后存活率的影响血清浓度（体积百分比）不同冷冻保护剂细胞的存活率（%）10%DMSO10%EG10%GL5%DMSO+5%EG5%DMSO+5%GL10%FCS58.63±2.75Bbc66.89±1.71Cab53.05±6.92Dc69.71±6.39Ga55.30±4.12Ic20%FCS61.33±7.07ABef68.11±5.87Cde58.10±4.76Df73.66±2.83FGd67.66±1.22HIde30%FCS71.23±3.73Ah76.02±6.56Cgh28.87±6.85Ei82.68±7.77Fg74.39±3.72Hgh注：①表2中，小写字母相同表示同行数值之间差异不显著，小写字母不同表示同行数值之间差异显著（P0.05）；大写字母相同表示同列数值之间差异不显著，大写字母不同表示同列数值之间差异显著（P0.05)。②细胞的存活率以平均数±标准差表示。表2：不同冷冻保护剂和血清浓度下小鼠胎儿成纤维细胞复苏后贴壁效果血清浓度（体积百分比）不同冷冻保护剂细胞的贴壁效果10DMSO%10%EG10%GL5%DMSO+5%EG5%DMSO+5%GL10%FCS满满满满满20%FCS满满满满满30%FCS满满中满满4讨论在低于-70℃的超低温下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将细胞降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不死亡，当以适当的方法将冻存的材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。但是如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞失水皱缩，甚至细胞膜上脂质分子受到损坏，细胞发生渗漏，产生溶质损伤；随着温度进一步降低，细胞内外都结冰产生冰晶损伤。因此，需要在溶液中加入冷冻保护剂，冷冻保护剂能迅速渗透进细胞内，同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质浓度，使细胞免受溶质损伤。所以渗透性越强、毒性越小的冷冻保护剂效果更好。常用的渗透性冷冻保护剂一般是一些小的分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇等。4.1冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞的冷冻效果实验表明，无论在哪一种血清浓度下，5%DMSO+5%EG的冷冻保护效果都是最好，10%EG次之，10%GL最差。可能是因为在三种冷冻保护剂中,EG的渗透性强于GL和DMSO,且EG毒性比DMSO和GL低,有利于小鼠胎儿成纤维细胞的存活；另外,三种冷冻保护剂只有EG在0℃以下为无晶体状态,可避免复苏时冰晶的产生，在细胞解冻过程中,能够较快的扩散到细胞外,从而减少了由于水分渗入引起细胞膨胀所导致的渗透性休克的发生,减少了细胞解冻过程中的损害。因此EG的冷冻保护效果较好DMSO在常温下对细胞的毒性较大，所以DMSO的冷冻保护效果较差；而甘油的冷冻保护效果最差可能是因为甘油进入细胞内需要的时间长,复温后移出慢造成的。甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂是，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等成分渗透到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。不同的冷冻保护剂有不同的优缺点，而联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液，可以取长补短达到更好的保护效果，提高细胞的存活率，因此5%DMSO+5%EG的冷冻保护效果最好。4.2血清浓度对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻效果的影响同一冷冻保护剂剂对细胞的冷冻保护效果随着血清浓度的增加而增强（10%GL除外）。血清可为细胞提供基本营养物质如氨基酸、维生素等，是细胞生长必须的物质。血清还能提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤，对培养中的细胞起到某些保护作用。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有