62食品微生物学检验 霉菌和酵母计数

中华人民共和国国家标准GB4789.15—2010食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:Enumerationofmouldsandyeasts中华人民共和国卫生部发布2010-03-26发布2010-06-01实施GB4789.15—2010I前言本标准自实施之日起代替GB/T4789.15-2003《食品卫生微生物学检验霉菌和酵母计数》。本标准与GB/T4789.15-2003相比，主要修改如下：——修改了范围；——修改了检验程序和操作步骤；——修改了培养基和试剂；——修改了设备和材料；——修改了附录。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB4789.15-1984、GB4789.15-1994、GB/T4789.15-2003。GB4789.15—20101食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数1范围本标准规定了食品中霉菌和酵母菌（mouldsandyeasts）的计数方法。本标准适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1冰箱：2℃～5℃。2.2恒温培养箱：28℃±1℃。2.3均质器。2.4恒温振荡器。2.5显微镜：10×～100×。2.6电子天平：感量0.1g。2.7无菌锥形瓶:容量500mL、250mL。2.8无菌广口瓶：500mL。2.9无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。2.10无菌平皿：直径90mm。2.11无菌试管:10mm×75mm。2.12无菌牛皮纸袋、塑料袋。3培养基和试剂3.1马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录A中A.1。3.2孟加拉红培养基：见附录A中A.2。4检验程序霉菌和酵母计数的检验程序见图1。GB4789.15—20102图1霉菌和酵母计数的检验程序5操作步骤5.1样品的稀释5.1.1固体和半固体样品：称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225mL无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。5.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。5.1.3取1mL1:10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中,另换一支1mL无菌吸管反复吹吸,此液为1:100稀释液。5.1.4按5.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。5.1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。5.1.6及时将15mL～20mL冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。5.2培养检样25g（mL）样品+225mL无菌蒸馏水，均质10倍系列稀释选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养皿内每皿中加入15mL～20mL马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基菌落计数报告28℃±1℃5dGB4789.15—20103待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。5.3菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）表示。选取菌落数在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。6结果与报告6.1计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。6.1.2若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度昀高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以昀高稀释倍数计算。6.1.3若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度昀低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。6.1.4若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以昀低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。6.2报告6.2.1菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。6.2.2菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。6.2.3称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。GB4789.15—20104附录A(规范性附录)培养基和试剂A.1马铃薯-葡萄糖-琼脂A.1.1成分马铃薯(去皮切块)300g葡萄糖20.0g琼脂20.0g氯霉素0.1g蒸馏水1000mLA.1.2制法将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸10min～20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121℃灭菌20min。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中A.2孟加拉红培养基A.2.1成分蛋白胨5.0g葡萄糖10.0g磷酸二氢钾1.0g硫酸镁（无水）0.5g琼脂20.0g孟加拉红0.033g氯霉素0.1g蒸馏水1000mLA.2.2制法上述各成分加入蒸馏水中，加热溶化，补足蒸馏水至1000mL，分装后，121℃灭菌20min。倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。GB4789.15—20105附录B(资料性附录)霉菌直接镜检计数法常用的为郝氏霉菌计测法，本方法适用于番茄酱罐头。B.1设备和材料B.1.1折光仪。B.1.2显微镜。B.1.3郝氏计测玻片：具有标准计测室的特制玻片。B.1.4盖玻片。B.1.5测微器：具标准刻度的玻片。B.2操作步骤B.2.1检样的制备：取定量检样,加蒸馏水稀释至折光指数为1.3447～1.3460（即浓度为7.9%～8.8%），备用。B.2.2显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90～125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。B.2.3涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察。B.2.4观测：将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样观察50个视野，同一检样应由两人进行观察。B.2.5结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野（1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测微器的一格）时即为阳性（+），否则为阴性（-），按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。