丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义研究进展

丙型肝炎可引起肝硬化、消化道出血、肝衰竭及肝癌，是欧美国家肝移植的主要原因。目前，全球有超过1.7亿人感染丙型肝炎病毒（HCV），其中每年有超过10万例慢性丙型肝炎（chronichepatitisC,CHC）患者发展为肝癌，进而出现消化道出血及腹积液。HCV的高度变异性、泛嗜性、免疫耐受、免疫损伤等因素是导致HCV感染慢性化的重要原因。慢性HCV感染日益成为一个世界范围内的公共健康问题，是全世界慢性肝病及死亡的一个主要原因。虽然目前有非常有效的治疗手段可以消除60%CHC患者体内的HCV，并且可以降低其余40%慢肝患者发展为肝硬化的概率。但不幸的是，即使在发达国家，由于缺乏充分的诊断和治疗，丙型肝炎引起的病死率仍呈上升趋势。在下一个10～20年内HCV慢性感染将成为全球范围内一个严重的健康问题，因为目前无症状感染者将出现严重的肝脏疾病且会发展成肝细胞肝癌。HCV主要通过血及血制品（例如输血、共用未消毒过的注射器和针头等）接触传播。1、HCV分子生物学特征HCV是一种正性单链RNA黄病毒，包括9400左右个核苷酸。HCV基因组具有一个单独的开放阅读框，编码一具有3010个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病毒粒形成所必须的结构和非结构蛋白。5＇非编码区（5＇NCR）是一个高度保守区域，对于HCV蛋白翻译的启动及核糖体的结合非常重要。结构区域包括核心和衣壳区域（E1和E2/NS1）。衣壳区域E2具有一个变异率达到50％的高变异区。非结构区域包括非结构区NS2、NS3、NS4和NS5。HCV具有高度的变异性，其变异率高达1.4～1.9×10-3/核苷酸/年。2、HCV流行病学目前，根据全世界不同地区分离的HCV不同株的全部或部分基因组系统进化分析，HCV呈现3个水平的遗传变异性：型（types）、亚型（subtypes）、准病毒株（quasispecies）。HCV至少可分为6个基因型（HCV1～6型），包含超过100个基因亚型（如1a、1b、1c、2a、2b等）。各型核酸序列之间相差31%~34%，氨基酸序列相差大约30%，而亚型序列之间相差约20%~23%，准病毒株序列之间相差1%~10%。最多的差别序列集中在E1和E2区，而core基因和一些非结构蛋白基因例如NS3则相对保守得多。各型之间序列最为保守的区域是5′UTR区。有几种HCV病毒株主要从东南亚被分离出，被命名为HCV7，8，9，10，11型，除了HCV10a型（目前被列入HCV3型），其余各型由于其系统进化上的相似性，被列入HCV6型。3、HCV基因分型方法对HCV基因组的某些区域（E1、NS5B）直接进行序列分析和系统进化分析，是HCV分型的“金标准”。目前，针对HCV5′UTR区序列多态性进行基因分型的技术有以下几种：①限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）即酶切分型：不同基因型HCVRNA的5′UTR序列具有高度的遗传保守性，由于基因的变异，该区的个别碱基排列不同，而产生的限制性内切酶的切点也发生变化，酶切后可得到不同cDNA片段，根据有无特异的酶切点及片段的长度，判断HCV基因型。操作过程繁琐，需明确酶切位点，才能确定最终型别。②基因型特异性引物扩增片段分型：根据不同HCV型在某一区段序列的差异，设计一系列特异性引物，不同型可扩增出不同的片段，并以此进行分型。这种方法对PCR引物的设计要求较高，要保证各型之间有较大差异，且每份样品需同时进行多次检测才能最终确定型别。③型特异性核酸探针杂交分型法：根据各型HCV某一区段的序列差异分别设计探针，与PCR产物杂交后进行PCR分型。目前在大多数实验室中使用的线探针（INNO-LiPA）杂交方法就是其中一种型特异性核酸杂交分型方法。④此外，还有一些方法用于HCV基因分型，例如Lareu等介绍了一种以SSCP为基础的基因分型方法，识别出1a、1b、2a、2b、2c、3和4基因型的独特性单链构象多态性。Livache等利用DNA芯片进行HCV基因分型。4、HCV基因分型意义4.1了解HCV型别进化、分布特征及探讨HCV传播途径HCV基因型的研究为了解各型在进化中的出现和变化提供线索，也有助于了解全球丙型肝炎的流行病学情况。据估计，HCV与人类一起在10～15万年前从非洲迁移出来并共同进化，但目前的HCV型别是近世纪才出现的。一项研究表明，HCV6型起源于700年前，HCV4型起源于350年前，而HCV1a、1b则可能起源于近100年前。在发达国家，HCV主要型的一些亚型在数十年前已经出现，并通过不同途径传播，其中主要有HCV1a、1b、2a、2b、2c、3a和4a。HCV1、2、3基因型在全球范围内广泛传播，HCV4型主要分布在北非和中东国家（如萨伊和埃及），HCV5型主要分布于南非，而HCV6型主要流行于东南亚。HCV7、8、9基因型仅发现于越南的CHC患者，HCV10、11基因型流行于印度尼西亚。在西欧，HCV1型占本地CHC流行的60%～65%，而HCV3a占大约20%；在美国，慢性HCV感染者主要为HCV1型（大约占72%），其次为HCV2型（大约为16%）、HCV3型（大约为10%）。在亚洲，HCV3、6型分布较广，且变异较多；而在非洲，HCV1、2、4型分布广且变异多。这都是上述HCV型别在一个地区长期流行的结果。近几年HCV3型在发达国家迅速流行，从五大洲分离的HCV3型病毒株比其他各型病毒株的遗传差异性更小。从上世纪60年代至今，HCV3型在静脉注射毒品者中迅速广泛的流行起来。有趣的是，由于系统化的血液和血制品筛查的普及，现在HCV1b的遗传进化步伐已大大减慢。相对的，在静脉注射毒品者中HCV感染的流行已失控，这与HCV1a、3a型的快速遗传进化相关。HCV1b型主要经血液传播，而HCV1a、3a主要经静脉注射毒品传播，在过去30～70年里在西方国家出现大量感染。在过去10年间，HCV1a、3a感染相对HCV1b明显增多，因为静脉注射毒品是目前HCV传播的主要途径，占新发病例的70%左右。同样，HCV4a型感染也在静脉注射毒品的HCV感染者中广泛流行。在日本，HCV1a、3a型患者十分罕见，大多数静脉注射毒品者为HCV1b型，其余为HCV2a、2b型。推断在未来的新发病例中，与静脉注射毒品传播有关的HCV1a、3a型占很大比例。4.2预测病情关于HCV基因分型在肝脏疾病预测中的意义是HCV研究中颇受争议的话题。但在HCV感染的整个过程中，宿主内HCV的疾病表现有明显的生物学差异。某些人群感染HCV后会在短时间内出现严重的并发症，如肝纤维化和肝癌；而某些人群即使感染时间很久也无任何并发症。因此，很有可能存在病毒或宿主方面的因素，包括HCV基因型，会导致这种疾病感染的进程。目前的一部分研究者们十分支持HCV基因型影响肝脏疾病进程的说法，而另一部分研究者们则持反对意见。这些结论都是通过间接的证据得出的，因为要进行非常准确的研究以回答这个问题很困难。在肝脏疾病进程中要将基因型作为一个独立影响因子从病毒载量、酒精摄入量、HCV感染时程等其他共同影响因素中分离出来，通常被认为不可能。患者也许不会提供诸如吸毒史或酒精摄入量等方面的准确信息，因此HCV感染的时间也是不可知的。而且因为HCV感染肝脏疾病的缓慢进程，回顾性研究往往不能进行。有研究报道在慢性HCV感染患者中，与其他基因型相比，HCV1b型感染与更严重的肝脏疾病、更迅速的疾病恶化相关。Zein等发现HCV1b基因型在肝硬化和肝脏失代偿要求肝移植的慢性活动性丙型肝炎患者中的感染率远远高于其他基因型。虽然这是通过间接证据得出的结论，但是可以预示HCV1b基因型和肝脏并发症发展之间的一定关系。而且，也有越来越多的证据表明肝细胞肝癌在HCV1b感染率高的日本的发生率也远远大于HCV1b感染率略低的欧洲或美国，且发生时间也大大早于后者。虽然某些研究否认了以上提到的联系，但是一个简单的事实可以重新解释这种联系：Zein等发现在美国，感染HCV1b基因型的患者年龄普遍高于感染其他型别者，感染HCV1b基因型的患者感染时间更早且病程更长。相同的现象在法国和西班牙都有报道。根据这种解释，因为HCV1b型的感染反映了更长的病程而不是破坏力更强的HCV形式，因此，HCV1b基因型是更严重的HCV相关性肝脏疾病的标志物。未来的研究仍然需要排除能够影响这种差别的其他宿主、病毒或环境的因素。4.3预测治疗反应目前大多数的研究认为HCV1b及1a基因型比HCV2型或3型对干扰素治疗的应答反应更差。Zein等报道HCV2型感染患者有60%～70%在干扰素治疗6个月后有应答，而HCV1型感染者只有10%～15%有应答反应。这种差别在干扰素治疗的持续性应答方面经常出现，并且不受肝脏组织学特点或治疗前HCVRNA水平的影响。因此有研究者提出，对CHC病人进行干扰素和病毒唑的联合治疗也许可以使基因型的差别没有那么明显。但是最近的治疗实验表明即使对CHC病人进行干扰素和病毒唑的联合治疗，非HCV1基因型的患者持续应答反应率仍然高于HCV1型感染者。一项关于干扰素加利巴韦林联合治疗CHC病人或者干扰素治疗无效的病人的研究发现，非1型HCV病人有比较高的持续应答，1型HCV病人治疗48周才达到非1型HCV病人治疗24周的效果。在日本HCV1b型感染标本内发现了HCV基因组的非结构区域存在一个“干扰素敏感”区。然而在美国和欧洲没有确认这项研究。这项发现的意义目前还未可知，在临床上应用这种昂贵而费力的操作来判断疗效是非常不切实际的。4.4有助于疫苗的研究不同HCV型的抗原决定簇常有较大的差异，因此有效的HCV疫苗应该能针对所有HCV基因型和亚型。而目前采用PCR法扩增某一基因型的HCV基因片段作为疫苗候选抗原，难以对其他型或亚型提供交叉保护作用。而针对HCV表达产物中的高度保守免疫性表位的疫苗则有望获得良好的免疫效果和保护性。高度变异的E蛋白可诱发特异性中和抗体，对HCV疫苗的设计具有重要意义，但要设计针对所有的HCV型及亚型的E蛋白疫苗，则几乎不可能。因此设计针对某一地区主要基因型的HCV疫苗更为现实，也可能是以后疫苗研究能取得突破的关键所在。综上所述，分子学诊断技术检测HCV-RNA更是重要的辅助手段，准确分型对丙型肝炎的预测和治疗具有重要的指导意义。反向杂交技术可同时检测不同类型的HCV病毒，相信不久的将来，基因芯片技术可同时检测更多类型的HCV病毒及其变异。HCV病毒的准确分型可助于更有效的进行丙型肝炎的临床诊断，以及结合基因型进行有效的个体化治疗，真正实现指导用药的作用。