973项目申报书——XXXXCB707400-G木质纤维素资源高效生物降解转化中

项目名称：木质纤维素资源高效生物降解转化中的关键科学问题研究首席科学家：曲音波山东大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部山东省科技厅二、预期目标总体目标：提出3-5套新的木质纤维素类生物质生物转化液体燃料和化学品的生物炼制技术方案，培养一支高水平的基础研究和技术开发队伍，最终为在我国建立大规模利用木质纤维素资源转化液体燃料和大宗化学品的新型工业体系，实现社会经济可持续发展提供理论与技术基础。五年预期目标：1）通过阐述植物生物质抗生物降解的组成和结构特征，建立起改造纤维生物质组成和结构以提高降解效率的理论体系；解析预处理技术对提高纤维生物质降解性的结构基础，提出高效、经济和实用的预处理技术方案；2）研究微生物对天然或预处理后底物的降解机理，特别是纤维素解聚机理、去结晶化途径以及提高纤维素酶的持续化降解能力的途径等，探讨采用现代系统生物技术，从复杂纤维质降解多酶体系中，筛选和发现新的高效、耐逆、适合工业要求的纤维质降解酶类；为降解不同的木质纤维素资源研制出低成本且高效的复合酶系；3）选育适于转化纤维质糖分为平台化合物的微生物，研究其代谢调控机理与机制，指导构建高效代谢工程菌，研究定向转化平台化合物的过程及相关产品的利用途径；进而通过对预处理、产酶、酶解和发酵的反应动力学、工程学和方法论的研究，将预处理技术、生物反应与分离过程耦合起来，提出新的生物炼制技术方案。4）从木质纤维素生物降解转化角度，构建纤维素降解和糖转化利用的数据库，其中包括木质纤维素原料组成与结构特征、纤维素降解微生物类群与特性、纤维素酶、半纤维素酶和木素酶及复合酶系，新型糖代谢的功能微生物等，建立专门的信息共享平台和网站，为实现大规模降解转化木质纤维素资源提供理论、技术和信息支撑。五年的可考核指标:提出2-3种新的高效、低能耗、少抑制物的预处理方案；筛选到5-10种新的关键酶或非酶降解因子，构建出高效的纤维素降解酶系，使酶解转化率大于90%；使吨乙醇用酶成本从2000元以上降到800元以下；构建出能全糖共利用、表达纤维降解相关酶组分的统合生物加工工程菌株3-5株，发酵性能达到国际先进水平；综合前述进展，设计出多技术集成、全组分利用、多产品选择、经济上有竞争力的木质纤维素生物炼制技术路线3-5条；发表相关研究论文200篇以上，包括SCI影响因子超过5的论文5-10篇，总影响因子超过300；三、研究方案1）学术思路：以研究植物木质纤维素类生物质对生物降解的抗性屏障及其破解之道为核心，深入研究微生物的多种多样的降解天然纤维的策略，探索人类干预生物降解过程，认识降解产物的复杂性，提高其降解转化效率，实现全部降解糖类的代谢转化，使之转而为人类可持续发展服务的可能途径。该学术思想可以用下图简示：2）技术途径：以植物有效防止微生物及酶降解的抗性屏障为切入点，从宏观（细胞）、微观（大分子）层次分析纳米级生物催化剂在降解过程效率低下的原因出发，研植物的防御屏障纤维素结晶结构多种高分子聚集细胞壁分层构造微生物的破解策略单酶组分分解反应游离复合多酶体系多酶组分协同作用固定多酶组合构造生物之间协同作用物理化学措施（预处理技术）蒸汽爆碎酸碱处理有机溶剂综合法预处理生物学措施新降解因子发现酶分子设计改造复合酶系的重构微生物代谢工程工程技术措施单一过程优化复合过程集成综合评价标准精炼方案设计究可能的物理化学预处理途径，使之有利于纳米级酶分子的作用（扩散、持续性降解与酶分子协同作用），同时，加强对微生物降解机理及其多样性、酶系组分协同作用及其合成调控机理的研究，对微生物酶分子和复合酶系进行定向进化或理性改造，加强对纤维降解糖类代谢网络的研究和代谢（进化）工程菌的构建研究，进而将一系列的工程技术手段集成起来，建立起高效的复合生物炼制转化系统。总的技术途径可以用下图表示：3)创新点与特色：（1）提出木质纤维素的抗降解性是生物质难以高效转化的核心问题，从纳米尺度和生物降解角度来研究木质纤维素超分子结构；（2）深入研究生物质的微生物降解的多样性，寻找新的生物降解因子，设计出高效的复合生物催化剂；（3）使用分子生物学改造相关的产酶和发酵微生物，设计和构建工程微生物，实现全糖定向生物转化为生物基产品，并使应用生物转化过程的成本及投资明显降低；天然超分子结构分析抗降解性研究预处理样品结构分析酶解过程构效关系酶系重构研究降解机理研究代谢工程改造代谢网络分析糖化、发酵工程技术研究酶系合成调控研究天然植物生物质预处理的木质纤维素材料纤维水解糖过程耦合集成代谢工程菌株纤维降解酶非酶降解因子高效降解酶系纤维素降解微生物发酵微生物燃料与化学品（4）完成木质纤维素类生物质生物转化技术的优化、耦合和系统集成，为生物质综合生物炼制产业的建立构建理论和实践基础。课题设置课题1、植物生物质抗生物降解屏障解析与破解途径探索研究内容：1.植物纤维类生物质抗降解屏障的定量解析高通量、快速纤维生物质结构和组成分析。利用近红外（NIR）结合GC-MS细胞壁组份分析等技术建立高通量分析、快速测定生物质结构和化学组成的技术，为明确生物质结构和组成与纤维生物质降解转化之间的关系以及鉴定经分子改良的优良品系提供便捷的分析手段。2.植物细胞壁生物质特性与降解转化效率的关系建立表征细胞壁超分子组成与结构的方法，测定木质纤维素生物质转化过程中基本的物理化学限制因子；利用木素酶、半纤维素酶、纤维素酶等处理，研究细胞壁超分子结构中不同组分的构效关系；基于木质纤维素超分子结构研究纤维素酶催化过程的定量构效关系，与酶分子催化动力学过程，基于定向进化、定点突变等新技术提高酶组分的活力。3．预处理过程中降解屏障的解构过程及其优化研究预处理技术对降解屏障的影响，建立高效打开酶分子通道的可行方案。考察不同预处理条件下的底物成分变化（如纤维素、半纤维素、木素含量变化）和结构变化（纤维素结晶度、聚合度变化）以及对可降解性能的影响。探讨预处理过程中发酵抑制物的生成动力学。经费比例：15%承担单位：中国科学院过程工程研究所、山东大学课题负责人：陈洪章学术骨干：赵建、王禄山、邱卫华课题2、木质纤维素生物降解多样性、新降解因子及相关机理研究内容：1.结晶纤维素结构解聚的分子机理及相关生物因子的分离鉴定与特征化在生化分离分析的基础上，通过对特定菌种或群落的不同酶活组分及非酶组分的组合配比，借助蛋白质组学定性和定量分析鉴定技术，分离鉴定能提高木质纤维素协同酶解活性的关键组分；结合底物超微结构观察及酶分子吸附模拟，深入研究阐述酶分子在木质纤维素高效酶解过程中的作用机制。2.天然纤维素降解的多样性分析2.1天然生境纤维素降解微生物群系分析。2.2分离新型纤维素降解微生物。2.3用比较基因组学技术探寻新的降解策略。3.新纤维素降解酶和降解因子的发现分析新生物降解因子参与纤维素降解或解聚作用的模式与相关机理。分析特定环境高效酶解体系的多样性与结构组成，从中寻找能促进提高现有酶系催化水解效率的新酶、非酶蛋白质或非蛋白因子，并获得新酶或非酶蛋白因子的克隆表达；在深入研究阐述这些新降解因子在特殊环境中木质纤维素高效酶解过程中作用机制的基础上，从中筛选和发现新的高效、耐逆、适合工业要求的促纤维质降解因子。经费比例：15%承担单位：中国科学院微生物研究所、山东大学课题负责人：董志扬学术骨干：陈冠军、刘巍峰、卢雪梅、倪金凤课题3、真菌游离酶系纤维素降解机理、酶系合成调控与高效酶系重构研究内容：1.真菌纤维素酶合成代谢调控分子机制研究在基本完成了对斜卧青霉原始菌株和抗降解物阻遏的工业高产纤维素酶突变株的全基因组测序的基础上，采用高通量基因组测序、数字化全基因组表达谱分析、荧光差异蛋白表达分析、RNA沉默、酵母双杂交等先进技术，通过比较基因组学、转录组学和蛋白质组学等方法，鉴定出关键节点基因/蛋白及其在纤维素酶表达调控网络中的位置和功能；并利用高效转化和基因评价体系对候选基因进行快速功能验证和评价，解析哪些基因或通路的改变导致了表型（高产纤维素酶突变、抗降解物阻遏）的变化，从而阐明纤维素酶合成的诱导机制、阻遏机理和高产纤维素酶突变的分子基础，为进一步提高菌株产酶能力和改进酶系组成提供指导。2.真菌木质纤维素降解复合酶各组分间的协同作用构建纤维素酶、半纤维素酶和最佳酶系的组成和比例以及纤维素材料物理化学性质的数据库，为降解不同的木质纤维素资源调制低成本且高效的复合酶系提供理论依据。分离鉴定能提高木质纤维素协同酶解活性的关键组分，构建特定环境高效酶解体系的结构组成及其相互作用模式，提高纤维素酶各组分酶协同水解效率，最大限度降低纤维素酶水解过程中产物反馈抑制效应。3.真菌纤维素酶合成代谢调控的改造及纤维素酶系的优化重构选育高分泌表达菌株；结合相关蛋白运输分泌蛋白的转录表达分析，探询纤维素酶的高分泌机制。构建纤维素酶的高效表达新系统，培育高效产酶优良菌种。针对丝状真菌纤维素酶合成代谢关键调控因子，通过嵌合体技术、基因敲除技术、RNA干扰技术和基因过量表达技术等对真菌纤维素酶表达调控网络进行人工改造，探索真菌纤维素酶整体表达水平提高及纤维素酶各组分酶表达水平的精确调控，重构具有对纤维素高效水解糖化能力的纤维素酶系，优化纤维素酶各组分的结构。经费比例：25%承担单位：山东大学、中国科学院上海生命科学研究院、天津工业生物技术研究所课题负责人：曲音波学术骨干：田朝光、方诩、汪天虹、严兴、张磊课题4、细菌酶复合体纤维素降解转化机理和纤维小体的解析、重构研究内容：1.高温厌氧纤维素降解细菌及纤维小体的筛选和多样性研究1.1从极端环境中筛选和构建厌氧纤维素降解菌群，建立不可培养微生物筛选手段，发掘高温厌氧纤维素高效降解细菌，结合16SrRNA基因分析，研究不可培养微生物的筛选策略；1.2运用高通量基因组测序技术，从高效纤维素降解群落中通过宏基因组分析获取关键基因信息。分析包括不可纯培养细菌在内的高温厌氧纤维素降解细菌群落中纤维素降解相关基因的分布、丰度、可能的协作及进化关系。通过蛋白质组学分析，结合生理生化验证，研究纤维素降解复合体，尤其是纤维小体的组成及多样性。结合微生物筛选以及酶活力验证，获得新的纤维素降解关键基因及辅助因子。2.纤维小体的解析、体外重构、性能改良2.1研究高效纤维素降解菌株的纤维小体的组成成分，分析各成员在空间上的排列及蛋白－蛋白相互作用，解析酶在空间上的集群与功能上的相互配合对结晶纤维素降解效率的影响。对关键蛋白或复合体进行三维结构解析，从分子水平分析结构与功能关系。2.2体外重构纤维小体。进一步了解及验证纤维小体的结构、功能及其装配机制，为其性状改良奠定必要的理论基础。对纤维小体骨架蛋白进行优化设计、表达；同时利用功能基因组学和蛋白质组学的方法，对纤维小体关键酶进行筛选并重组表达，在此基础上体外构建人工纤维小体，并进行性状鉴定。2.3对纤维小体进行性能改良：广泛筛选各种互补性酶组分，在底物特异性、抗逆性、催化活性、功能互补性等方面寻求最佳酶组合，充分发挥纤维小体固有的协同效应。对关键酶进行理性设计或定向进化改造，以期提高对预处理过程产生的抑制物的抗逆性，拓宽底物谱，解除产物抑制，最终提高重构纤维小体的总体木质纤维素降解效率。最后通过设计紧凑型微型纤维小体，降低体外重组纤维小体的难度，以期减少酶生产成本，最终达到实用化。3.纤维小体的合成代谢调控机制及CBP乙醇生产技术路线的设计及改造3.1对中高温产纤维小体模式菌株，包括C.thermocellum和C.cellulolyticum，进行转录组学分析分析，比较菌株在含有纤维素或者其它碳源培养基中基因的表达情况，通过蛋白质组分析纤维小体的组成变化，根据这些组学数据，研究嗜热厌氧菌纤维小体在功能上的进化、表达和调控机理。3.2对模式菌株热纤梭菌（C.thermocellum）LQR1进行遗传改造，设计高温厌氧细菌混合培养或热纤梭菌超级工程菌产乙醇的CBP路线。通过遗传改造，提高纤维小体的质量和数量，敲除产酸代谢途径，通过互补混合培养实现五、六碳糖共代谢，提升整体纤维素降解效率，降低生产