东北师大薄层色谱法

1薄层色谱法测定硝基苯胺异构体中邻硝基苯胺1.实验目的1.1掌握薄层分析法的基本原理和操作技术1.2掌握CD－60薄层扫描仪使用方法1.3学习薄层色谱法定性定量测定邻硝基苯胺的原理和方法2.薄层色谱法原理簿层色谱是一种在薄层板上进行色谱分离和分析物质组分的色谱分析方法.通常是把固定相均匀地涂布在玻璃板或金属板上，经活化处理后将样品溶液点在薄层板上。然后把薄层板的这一端浸入展开剂中进行展开。根据各组分在固定相及流动相中有不同的吸附、溶解等能力，经过固定相及流动相对组分的吸附、解吸、再吸附、再解析等反复作用，使各组分在薄层板上表现出不同的移动速度从而得到分离。通过比较分离后的斑点移动的距离可对样品进行定性分析，常以Rf值作为比较的参数，Rf值定义为斑点中心移动的距离与溶剂自样品原点至前沿移动的距离的比值。RF值的数学定义为：原原点中心的到展开后的组分斑点中心距离a原点中心到溶剂前沿距离b比移值是薄层色谱法的重要参数，它与化合物种类，吸收剂性质，温度，展开剂以及实验条件等因素有关。由于影响比移值因素较多，因此，实验室一般须用已知的组分与混合试样在同一实验条件进行层系，根据斑点对应位置，确定各组分的比移值，对单个组分来说，应是比移值愈大愈好，而对混合物组分的分离来说，则要求各组分的比移值间的差愈大愈好。斑点的观察，对有色样品，可在展开过程中用肉眼观察到斑点移动，比移值的计算非常方便。对无色试样，可在展开一定时间后，用适当的显色剂喷洒直到溶剂前沿的全部板面，使斑点显色，从而计算比移值。样品定量分析时，可用微型注射器定量点样，展开后用簿层色谱仪在520nm波长下扫描，测定斑点的积分值，通过积分面积求出未知物的含量。即：样品浓度=标准品浓度*标准品积分面积/样品积分面积3.仪器与材料：RF=23.1玻板：除另有规定外，用10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑，平整、洗净后的不附水珠，晾干。3.2固定相或载体：用硅胶G做固定相，其颗粒大小，一般要求直径为10—40μm。用羧甲基纤维素钠水溶液（0.5—0.7%）适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。3.3试剂：展开剂－环己烷：乙酸乙酯（9:1）；样品溶液－1%邻硝基苯胺、1％对硝基苯胺苯溶液，于100mL容量瓶中。3.4点样器：微量注射器或定量毛细管，应能使点样位置正确集中。3.5展开室：应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。4.操作方法：4.1薄层板制备：除另有规定外，将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2—0.3mm），取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟。即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。在层析缸中加入展开剂70mL。4.2点样：除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.5cm，点样直径为2～4mm，点间距离约为0.9-1.5cm，用微量注射器分别将标样点在薄层板上：标样分别点2μL，样品点2μL。点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时注意勿损伤薄层表面。4.3展开：将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边1.0—1.5cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为7-9cm），取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测，4.4CD－60薄层扫描仪操作步骤：用CD-60薄层扫描仪结合具体情况，选择反射或透射法及双波长或单波长扫描方式对色谱斑点检测。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。CD－60薄层扫描仪操作步骤如下：1.连接电源。此时主开关的绿灯亮，表示电源已接通。选择合适的灯源：200～370nm选择汞灯，370～780nm选择钨灯。将处理好的硅胶板放在仪器内的卡槽中，并夹紧。2.双击桌面上的DESAGA图标，仪器将进行初始化即自检。3.记录X、Y值，点击ProQuant1对话框最下行的”编辑方法”，输入XY值，选择测量方式：反射法，光标尺寸调至0.2×4mm。的位置上。4.点击ProQuant1对话框上的“开始扫描”，开始对样品进行扫描。36.扫描结束后处理吸收峰。双击吸收峰将其放大，点击“斑点列表”可查看斑点的峰高，峰面积，Y轴位置等信息。7.计算：标准品及样品的积分面积在列表中，用对比法计算出样品中待测物质的含量。8.保存。