DNA是生物遗传的主要物质基础

DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。中心法则1964-1970劳氏肉瘤病毒的遗传方式致癌RNA病毒病毒（复制）复制转录DNARNA蛋白质翻译逆转录1958年，遗传信息的单向二、DNA的合成（一）依赖于DNA的DNA合成（DNA的复制）1、DNA的半保留复制：在1953年，Watson和Crick在建立双螺旋DNA结构的基础上就提出了DNA复制的半保留复制假说。他们推测DNA复制时，两链先分开，然后用碱基配对的方式，按照单链DNA的核苷酸顺序合成新链，以组成新DNA分子。这样形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基顺序完全一样，每个子代分子的一条链来自亲代DNA、另一条链是新合成的，这种方式称为半保留复制（如右图）。DNA的半保留复制定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制半保留复制的实验证据:1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度DNA的半保留复制的生物学意义：DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。2、DNA复制的起始点和方向：DNA复制开始于染色体上固定的起始点。起始点是含有100-200个碱基对的一段DNA。DNA的两条链在起始点分开形成叉子样的“复制叉”，随着复制叉的移动完成DNA的复制过程。细胞内存在能识别起始点的特种蛋白质。DNA复制可以朝一个方向进行，也可以朝两个相反的方向进行（如有图）。其证据来自放射自显影实验或电子显微镜观察。大多数生物染色体DNA的复制是双向进行的。大肠杆菌染色体DNA的复制经证明是双向进行的（如右图）。在迅速生长的原核生物中，第一个染色体DNA复制尚未完成，第二个DNA分子就在同一个起始点上开始复制，其复制叉移动的速度约为105碱基对/分。真核生物染色体的不同位置上有多个起试点，如在30000个碱基对长的果蝇染色体DNA上有2000-3000个起试点，如下图：真核生物的复制叉移动较慢（5x102-5x103碱基对/分。但由于同时起作用的复制叉数目很大，所以复制的总速度比原核生物要快。3.与DNA复制有关的酶和蛋白质原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA。引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物。（1）DNA聚合酶：DNA复制过程中最基本的酶促反应始四种脱氧核苷酸的聚合反应。1956年Kornberg等首先从大肠杆菌中分离出催化此反应的DNA聚合酶。在大肠杆菌中现已发现三种DNA聚合酶，分别称为聚合酶Ⅰ、聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ。三种酶的作用和活力大小见下表。聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ功能5‘→3’的聚合酶作用5‘→3’的外切酶作用3‘→5’的外切酶作用相对分子量每个细胞的分子数活性（37℃时每个酶分子酶分钟聚合的核苷酸数主要作用+++109000400600主要对DNA损伤修复,切除引物+-[phone]紫外线损伤的修复+++14000010-209000DNA复制的主要聚合酶表1.大肠杆菌DNA聚合酶在大肠杆菌中发现有三种DNA聚合酶（用突变株研究其功能）：⑴DNA聚合酶Ⅰ:单体酶,多肽链内含一个锌原子（其鳌合剂是O-二氮杂菲），多功能酶。它具有53聚合酶功能（对脱氧核苷酸的选择）；3’5’外切酶活性（对双链无作用，校对功能。但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）及5’3’外切酶活性（双链有效，主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其空隙的填补）；在DNA链的3形成焦磷酸解（生理意义不大）；无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。⑵DNA聚合酶Ⅱ：多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3’5’外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。⑶DNA聚合酶Ⅲ：是原核生物DNA复制的主要聚合酶，该酶由10种亚基组成，其中、、形成全酶的核心酶。具有5’3’DNA聚合酶活性（亚基，速率高）；具有3’5’外切酶（亚基）的校对功能，提高DNA复制的保真性；还具有5’3’外切酶活性（单链有效，其意义未知）。另外:（4）DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤时，诱导产生。许多研究证明：DNA聚合酶Ⅲ是完整大肠杆菌细胞中主要负责DNA链延长的酶。它以一个相对分子量约为450000，称为“DNA聚合酶Ⅲ全酶”的大复合物的形式起作用，全酶有好几个亚基（如下左图）。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化一万倍的DNA聚合酶Ⅲ，得到的主要成分为相对分子量140000的多肽（α亚基）。在复合物中的β亚基（也称为DNA聚合酶Ⅲ辅酶）的功能是识别引物并使DNA母链与引物链结合。一旦全酶结合在正确的起始位置上，DNA聚合酶Ⅲ辅酶就以游离的形式释放，随后DNA聚合酶Ⅲ复合物催化子代DNA链的延长（右图）。DNA聚合酶催化的反应可以利用双链作为模板和引物，也可以利用单链作为模板和引物。如下图中，A为单链自身回折作为模板，形成发夹环结构。B、C为双链作为模板，其中C是由于酶离开原先的模板，开始复制互补链而形成分枝结构。D为环状DNA进行的反应。A、C只存在于体外酶促合成的DNA分子中，它使DNA的变性行为异常，并且失去遗传活性。DNA聚合酶具有”校对“作用：DNA聚合酶的3‘→5’的外切酶活力是校对新生DNA链和改正聚合酶活性所造成”错配“的一种手段。当因聚合酶活性的作用插入一个错配的核苷酸时，酶能识别这种”失误“并立即从新DNA链的3’端除掉所错配的核苷酸。所以当复制叉沿模板链移动时，所加入的每个脱氧核苷酸单位都将受到检查（如右图）。DNA聚合酶的校正功能十分有效，其准确率达到每聚合104个核苷酸单位至多出现一个错配的核苷酸。复制的准确性高于转录和转译过程。这点非常重要，因为复制的错误可引起突变或致死。由上可以归纳出DNA聚合酶的反应特点：①以四种脱氧核糖核苷三磷酸作为底物；②反应需要接受模板的指导；③反应需要引物3’－羟基存在；④DNA链的延长方向为5‘→3’；⑤产物DNA的性质于模板相同；⑥合成过程种有校正作用。这就表明了DNA聚合酶合成的产物是模板的复制物。真核生物DNA聚合酶：主要作用类似于大肠杆菌聚合酶，但有不同。现已发现四种，分别以α、β、γ、δ来命名（有资料介绍有5种，即多一种ε，它在结构和性质上类似于δ，其主要功能时参与DNA的修复），其各种酶的特性归纳为下表：表2.真核生物DNA聚合酶聚合酶α聚合酶β聚合酶γ聚合酶δ分子量亚基数细胞内分布酶活力占总量的百分比核酸外切酶活力5‘→3’聚合作用110-220000多个细胞核-80%无有450001个细胞核10-15%无有600001个线粒体2-15%无有1220001个细胞核10-25%3‘→5’外切酶活力有在真核细胞内有五种DNA聚合酶（与细菌DNA聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向）αβγδε定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核3‘-5’外切--+++酶活性功能引物合成修复作用线粒体DNA的复制核DNA的复制修复作用在复制过程中，真核细胞有两个相互协作的酶，即α负责后随链，δ负责前导链的合成，如下图：3.DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能在模板链上连接DNA和DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。3‘5‘3‘5‘OHP连接酶的反应机制：酶+NAD+(ATP)酶-AMP+烟酰胺单核苷酸（PPi）酶-AMP+P-5‘-DNA酶+AMP-P-5’-DNADNA-3’-OH+AMP-P-5’-DNADNA-3’-O-P-5’-DNA+AMPDNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用4.拓扑异构酶:催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其他转变方面起重要作用。5、解螺旋酶（解链酶）：通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。这类酶能通过水解ATP获得能量来解开双链，每解开一对碱基，需要水解2分子ATP成ADP和磷酸盐。分解ATP的活力要有单链DNA的存在。如双链DNA中有单链末端或缺口，解螺旋酶即可结合于单链部分，然后向双链方向移动。大肠杆菌解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可以沿模板链的5‘→3‘方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3’→5‘方向移动。这两种解螺旋酶的配合作用推动着DNA双链的解开。6.其它蛋白因子：⑴单链结合蛋白(SSB-single-strandbindingprotein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。防止单链的重新聚合和单链的降解。⑵引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。7.RNA引物:DNA的合成需要一小段RNA引物.