XXXX年 分子生物学实验(1)

分子生物学实验实验一DNA重组实验要求1、实验室内禁止饮食、勿高声谈话、随意走动。2、课前预习、课中认真操作和课后的实验报告。3、妥善保管好每组的实验器具。4、实验操作要求人人动手。5、每次实验完毕要验加样枪的准确性，然后做好值日卫生工作。第3周DNA重组实验第4周原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳分析第5周WesternBlottingI第6周WesternBlottingII时间分配实验内容10:00-10:30酶切加样10:30-12:3037℃酶切；原理讲述12:30-13:30回收13:30-14:00连接加样14:00-16:0025℃连接；休息16:0-16:30转化16:30-17:3037℃孵育培养；倒平皿17:30-18:00涂布学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将T载体上所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到表达载体上。一、实验目的二、实验原理限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择表达载体pET28a多克隆位点上相应的限制性内切酶切割；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。实验材料：外源片段DNA——CHY基因的PCR产物；载体——pET28a-egfp（含有绿色荧光蛋白DNA片段）；BL21感受态细胞（鼎国公司）；培养皿；37℃摇床及培养箱。实验试剂：限制性内切酶(EcoRI;XhoI)（TaKaRa公司）；T4DNA连接酶；LB液体培养基和固体培养基；卡那霉素（kana）:工作浓度100μg/mL；氯仿/异戊醇（24:1）；无水乙醇；3MNaAc；70%乙醇；ddH2O。三、实验材料与试剂凝乳酶四、实验步骤1．载体pET28a-egfp和外源DNA片段的限制性酶切：（50μl反应体系，用1.5mltube，冰上操作）试剂加样量DNA5μlEcoRI1μlXhoI1μl10×buffer5μlddH2O38μl37℃反应1hr。分别取8μl外源片段酶切产物和5μlpET28a-egfp酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按2-5步纯化、回收DNA。2．加入ddH2O200μl（扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000g离心10min；3．吸取上清200μl，加3MNaAc15μl和无水乙醇400μl，-20℃放置15分钟以上；4．13000rpm离心10分钟；5．倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10μlddH2O（1.5mltube中），pET28a-egfp溶于10μlddH2O（1.5mltube中）；6．连接反应（15μl体系）：试剂加样量CHY10μlpET28a-egfp2.5μl10×buffer1.5μlT4Ligase1μl25℃30min7.取1只灭菌的EP离心管，a.每管加入感受态悬液50ul及连接产物或质粒50-100ng15ul（无菌操作）；b.混匀（不可以振荡），冰浴30min；c.取出放入42C水浴中热休克90秒，不要摇动试管，迅速放入冰中，冰浴5min。d.向每管中加入无抗生素的LB液体培养基400ul，该溶液称为转化反应液。混匀后，于37C（100～150rpm）温和摇振培养60min，使细胞恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（kanar）。8.制备含有适当抗生素的LB培养基平板。9.筛选培养：a.取转化反应液200l，均匀涂布于含有Amp抗性的LB培养基平板上。b.将涂布好的平皿置37C平放20min，然后倒置培养12-16h。（期间应注意观察，当菌落生长良好，而相邻菌落尚未相互重叠时，即停止培养。若发现菌落太多或太少时，应改变转化反应液的用量，重新涂布培养。）1.使用酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10以下，否则，酶活性将受影响。2.吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，不要互相污染试剂。3.加试剂前，应短促离心10秒钟，然后再打开管盖，以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。4.防止杂菌和杂DNA的污染。整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等应是新的，并经高压灭菌处理。5.离心操作一定要在低温下进行，所用的水、Eppendorf管都要在冰上预冷，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。6.37℃振荡培养时间不宜过长，否则会出现很多的卫星菌落和轻微的菌膜干扰。7.平板涂布重组体时，应避免反复来回涂布，因为感受态细胞的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂、死亡，影响转化效率。8.涂布后培养时间不宜超过24h，否则会出现卫星菌落。五、注意事项试验设定二组，1、宿主菌涂布；2、转化连接产物的受体菌涂布。最后比较培养好的平皿，可以看到：①含抗菌素培养皿上的受体对照组并没有长出菌落，证明受体菌对抗菌素是敏感的，并证明在本实验中没有发生抗药性突变。②转化连接产物的受体菌在含抗菌素的培养皿中也长出了菌落，这不是受体菌的抗药性的自发突变株，肯定是质粒DNA转入细菌后的转化体，这是因为带抗药性的质粒DNA转入细菌后，使转化体产生抗药性这一遗传特性的结果。六、结果观察及分析的原则由于此实验过程涉及多个实验环节，如酶切、连接、感受态细胞、转化等各方面的效率，因此在实验中经常会出现一些问题。如：1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。2.DNA浓度过低时可适当浓缩后再酶切，浓度过高可能酶切不完全可以适当稀释酶切。3.反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应，如果底物DNA较多可以延长酶反应时间。七、常见问题分析及处理1.限制性酶切反应及DNA连接反应要注意哪些要点？2.如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动，你认为可能是什么原因？3.转化后，涂布之前为何要在400μLLB培养基中培养1h？4.如何制备平板？重组体涂布时应注意哪些操作？5.影响转化的主要因素有哪些？八、思考题