《肽与蛋白质》备课材料1

1《肽与蛋白质》备课材料杨旭2000年9月3日于北京开始准备第一章：绪论（2学时）关于我们的教材和教学大纲-本书《蛋白质分子基础》是高等教育出版社出版的大学教材。专供生化专业和分子生物学专业的本科学生使用。-我们现在拿到手的是第二版第二次印刷本（1999年11月）。是目前国内可以找到的最新版本的该课教材。目前北京大学生化本科学生也在使用本教材。-该教材由北京大学生命科学院茹炳根教授（国家教委任命的本书主审）亲自推荐，茹教授是我国“蛋白质与肽”领域的学科带头人。-我们采用的教学大纲也是茹教授所编写的。一、蛋白质的重要地位（pp1-1）组成生命的最基本的物质：水、蛋白质、核酸、脂肪、糖类、无机盐。生物体是靠蛋白质来进行和完成生物功能的蛋白质和肽领的研究是生命科学的重要组成部分之一，是生命科学的前沿。人类基因组研究计划（HumanGenomeProject,HGP）以趋完成，后人类基因组研究计划将包括（谷志远，第173页）：-基因克隆计划；-基因组多样性计划；-cDNA（互补DNA）计划；以上三项都是HPG计划的延伸-蛋白质计划：从基因图谱转化出蛋白质一级结构（信息的-电脑；物质的-体外翻译），大规模地研究基因产物-蛋白质的种类、结构与功能；-细胞计划：以信号传递为主线，阐明发生在细胞中的生命现象的奥秘。蛋白质计划、细胞计划则比前三项更具有开创性。二、蛋白质的组成（pp1-7）氨基酸的结构通式：氨基酸的共同特点是：与羧基相邻的α-碳原子都有一个氨基，故称α-氨基酸，结构通式如下。各种氨基酸的区别在于侧链基团（R-基团）不同。氨基酸分类：-构成蛋白质的氨基酸：共20种，都是L-构型的α-氨基酸；-氨基酸衍生物：共5种：L-胱氨酸、L-羟脯氨酸、L-羟赖氨酸、L-甲状腺素、锁链素；-非蛋白质氨基酸：200多种，常见的如表1-4所示。按构成蛋白质的氨基酸按侧链基团的物理性质分类：见表1-12-脂肪族类：甘氨酸G、丙氨酸A、纈氨酸V、亮氨酸L、异亮氨酸I；-羟基类：丝氨酸S、苏氨酸T；（―OH）-酸性氨基酸：天冬氨酸D、谷氨酸E；（2个羧基：―COO―）-碱性氨基酸：组氨酸H、赖氨酸K、精氨酸R；（含氨基或胺基）-酰胺类：天冬酰胺N、谷氨酰胺Q；（酰胺基）-含硫类：半胱氨酸C、甲硫氨酸（蛋氨酸）M；（含硫）-芳香族类：苯丙氨酸F、酪氨酸Y、色氨酸W；（含苯环）-亚氨基酸：脯氨酸P（唯一不符合通式的氨基酸）。按构成蛋白质的氨基酸按侧链基团的疏水性分类：-疏水氨基酸：丙氨酸A、纈氨酸V、亮氨酸L、异亮氨酸I、甲硫氨酸M、脯氨酸P、苯丙氨酸F、色氨酸W（Δgt≥0.5）；-强亲水氨基酸：天冬氨酸D、谷氨酸E、组氨酸H、赖氨酸K、精氨酸R（酸性碱性氨基酸）（Δgt-2.5）。-弱亲水氨基酸：所有其它氨基酸（Δgt-0.3~0.4）。按构成蛋白质的氨基酸按侧链基团的带电荷情况分类：-不带电荷：丝氨酸S、苏氨酸T、天冬酰胺N、谷氨酰胺Q、半胱氨酸C、酪氨酸Y（羟基类、酰胺类等）；-中性溶液带负电荷：天冬氨酸D、谷氨酸E（酸性氨基酸）；-中性溶液带正电荷：组氨酸H、赖氨酸K、精氨酸R（碱性氨基酸）。三、蛋白质的分类（pp7-8）按蛋白质化学组成分类：简单蛋白质、结合蛋白质简单蛋白质进一步分为七小类（根据溶解性质的不同）：-清蛋白类（albumins）：又称为白蛋白，营养成份；-球蛋白类（globulins）：例如：免疫球蛋白；-组蛋白类（histones）；存在于染色体中；-精蛋白类（protamines）：存在于精子中；-谷蛋白类（glutelins）：存在于禾本植物种子；-醇溶蛋白类（prolamines）；溶于７０－８０％乙醇；-硬蛋白类（scleroproteins）：角蛋白、胶原蛋白、丝心蛋白。结合蛋白质进一步分为七小类（根据非蛋白质成分的不同）：-糖蛋白类（glycoproteins）：与糖类结合；-核蛋白类（nucleoproteins）：与核酸结合；-脂蛋白类（lipoproteins）：与脂类结合；-磷蛋白类（phosphoproteins）：与磷酸共价结合的蛋白质；-金属蛋白类（metalloproteins）：与金属离子直接结合的蛋白质；-血红素蛋白类（hemoproteins）：与血红素结合的蛋白质；-黄素蛋白质（flavoproteins）：与黄素核苷酸结合的蛋白质。其他分类：按功能分类、按蛋白质空间结构分类。L-：是D-构型氨基酸的立体异构体，蛋白质中都是L-构型氨基酸（具有L旋光性）。α-碳原子：联接氨基酸四个取代基（羧基、氨基、氢原子、侧链(R-)基团的碳原子。pK：解离常数。pI=1/2(pK1+pK2)；pI：等电位点，蛋白质在溶液不向正或负极移动。3四、蛋白质结构简介：肽键（peptidebond）：是一分子的氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的酰胺键（-COOH+-NH2=-CO-NH-+H2O）。多肽链（polypeptidechain）、氨基末端（aminoterminal）、羧基末端（carboxylterminal）：许多氨基酸借助肽键连接成的长链称为多肽链。多肽链的两端的α-氨基和α-羧基都是游离的，一般将多肽链游离的α-氨基（写在分子式左边）称为氨基末端或N端；游离的α-羧基（写在分子式右边）称为羧基末端或C端。肽（peptide）、多肽（polypeptide）、蛋白质（protein）：由氨基酸脱水缩合的化合物称为肽（或称缩氨酸）；通常将10个以上氨基酸组成的肽称为多肽；分子量大于5000（约40~50个氨基酸残基）且具有稳定的高级构象（空间结构）的称为蛋白质。蛋白质分子的结构层次：一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→四级结构一级结构（primarystructure）：又称化学结构，指的是蛋白质分子中氨基酸的排列顺序，包括组成一个蛋白质分子的多肽链的数目和多肽链中氨基酸的精确序列两个重要方面。二级结构（secondarystructure）：指的是多肽链主链骨架中若干肽段各自沿着某个轴盘旋或折叠，并以氢键维持，从而形成有规律的构象（空间结构）。如α-螺旋、β-折叠、β-转角等。超二级结构（supersecondarystructure）：指的是蛋白质分子中的一些二级结构单元，在空间进一步聚集、组合在一起，形成的一种高于二级低于三级结构的新的空间层次。常见的超二级结构有αα、βαβ、βTβ、βββ等。结构域（domain）：指的是由超二级结构形成的紧密、稳定，而且在蛋白质分子构象上明显可分的区域。一般由50-400个氨基酸组成，它们分别担负蛋白质分子的不同功能，是蛋白质分子的生物功能实体。三级结构（tertiarystructure）：指的是一条多肽链在二级结构的基础上，由于其顺序相隔较远的氨基酸残基侧链的互相作用（氢键、疏水键、范德华力、离子键、配位键、二硫键），而进行范围广泛盘旋和折叠，从而产生特定的不规则的球状结构。四级结构（quarternarystructure）：指的是各个亚基（亚单位）在多聚蛋白中的空间排布及亚基的互相作用。4第三章：蛋白质一级结构测定（7学时）第一节：蛋白质序列测定的基本战略和步骤（pp86-88）一、序列测定的基本战略（pp86-87）1．S.Moore基本战略（又称两种或两种以上的特异性裂解）这种战略由美国科学家S.Moore于50年首创，且至今仍在沿用。它的要点是：⑴用两种方法分别将蛋白质的肽链专一性的切断，各自得到一系列的肽段；⑵将这些肽段分离纯化，测出它们的序列；⑶将两套肽序列的结果对在一起，得到蛋白质的一级结构。原则上，只要两套断链的切点都不同，就能解出一级结构。（图3-1A）由于此法所用的试剂易得，所以现在仍然被广泛使用。（参见111页，图3-15）特异性裂解，根据裂解的方法可以分为两类：酶法裂解：产生的肽较小（5-20个残基），适用于手工序列分析；化学法裂解：产生的肽较大（50-100个残基），适用于序列机分析。2．逐级特异性裂解战略（见图3-1B）是70年代后提出的方案。此法优点是：可以防止盲目性，有利于以后肽链的重排，也可以使分离纯化简单；缺点是：所需的断裂试剂种类多，选择合适的断裂试剂很难。3．选择测序战略的主要依据所掌握和具备的肽链裂解方法；所具备的分离纯化条件；寻找接头肽（重叠肽）。二、序列测定前的准备工作及测定的一般步骤（pp87-88）㈠、序列测定前的准备工作1．蛋白质制剂的提纯和纯度要求：蛋白质制剂的提纯方法详见第二章。一般要求其纯度在97%以上，如果杂蛋白含量超过了5%时便很难测定序列，蛋白质制剂中的杂质蛋白含量达到一定程度时，一级结构的研究结果将是没有意义的。2．蛋白质的分子量测定：这个数据对于确定蛋白质肽链的组成是很重要的。测定分子量的目的主要是为了估计序列工作量的大小。对分子量测定的准确性要求不高，误差在10%左右就足够了。常用的方法有：凝胶层析法：包括“凝胶柱层析测定法”和“凝胶薄板层析法”。第一版103-106页SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：第一版106页；第二版57-59页沉降分析法：包括“沉降速度法”和“沉降平衡法”第一版101-103页3．确定组成蛋白质的多肽链（亚基）的数目、种类和大小：亚基的数目：采取亚基拆离处理之后，如果蛋白质的分子量变小了，就说明蛋白质是由多条肽链组成。测量每分子蛋白质所含的N-末端残基数目，或者SDS凝胶电泳带的数目，都可以确定亚基的数目。拆离处理的方法根据亚基间交联的化学键的种类有所不同：如非共价交联，可用高浓度变性剂（如58mol/L尿素）拆离；二硫键共价交联，可用过甲酸氧化法和还原-羧甲基化法拆离。亚基的种类：组成蛋白质的亚基可能是相同的，也可能是不同的。是否相同，可以用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法、N-末端测定法和高压液相色谱法（HPLC）来确定。如果相同，则不需要分离处理；如果不相同，就要进行分离和提纯处理，并制备供分析用的足够的样品。亚基的分子量：测量方法与蛋白质的相同。㈡序列测定的一般步骤其工作内容包括：1．蛋白质和肽的氨基酸组成分析2．末端氨基酸的测定3．肽链的专一性水解和肽段的分离纯化4．肽段的序列测定5．由已知序列肽段建立蛋白质一级结构以下各个步骤作详细的介绍。第二节：蛋白质和肽的氨基酸组成分析（pp88-92）氨基酸组成成分分析是蛋白质化学的重要内容之一，也是序列测定的重要组成部分。要测定蛋白质的氨基酸组成，首先要把蛋白质水解成游离氨基酸的混合物。一、蛋白质的水解（pp88-89）常见的有：盐酸水解法、磺酸水解法、酶水解法，以下分别介绍：1．盐酸水解法：本法是目前应用最广泛的一种方法。方法较为简便，而且，除了能够较满意的得到除色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）之外的所有氨基酸。方法：使用重蒸5.7mol/L盐酸（恒沸点盐酸），在密闭的水解管中，加热至105~110℃进行蛋白质水解。持续24~72小时。注意：⑴色氨酸（Trp）基本上全部被破坏，必需用其它的方法测定；⑵含硫类的半胱氨酸（Cys）可被部分破坏和氧化，最好是在氧化成稳定的磺基丙氨酸后再测定其含量。⑶羟基类的丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）分解缓慢。要准确测定，需要做几个水解时间的实验，然后测定的氨基酸含量，再外推到分解时间为零时的含量。⑷含有脂肪族的缬氨酸（Val）和异亮氨酸（Ile）由于支链的空间障碍，而水解缓慢，所以水解的时间要比较长。⑸酰胺类的天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）在酸水解时，会脱酰胺，全部变为天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）。可以利用脱酰胺时放出的氨气的数量来测定它们的总量。⑹含硫类的甲硫氨酸（Met）盐酸水解时，易被氧化，转变为甲硫氨酸砜，损失20%左右。可以用这一数值来进行校正。⑺如果在水解时加入0.1~1.0%巯基乙酸和0.05~0.1%的苯酚，可以使丝氨酸（Ser）和酪氨酸（Tyr）回收率明显提高，甲硫氨酸（Met）也不破坏。2．磺酸水解法：磺酸是非氧化性强酸，用它来代替盐酸有许多优