《生物化学》实验指导书

《生物化学》实验指导书适用专业：生物技术、生物工程、食品科学与工程生物与食品工程学院生物科学系1生物化学实验细则为了保证生物化学实验的顺利进行，培养同学们掌握良好、规范的生物化学基本实验技能，特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。1.实验前应提前预习实验指导书并复习相关知识。2.严格按照生物化学实验分组，分批进入实验室，不得迟到。非本实验组的同学不准进入实验室。3.进入实验室必须穿实验服。各位同学进入各自实验小组实验台后，保持安静，不得大声喧哗和嬉戏，不得无故离开本实验台随便走动。绝对禁止用实验仪器或药物开玩笑。4.实验中应保持实验台的整洁，废液倒入废液桶中，用过的滤纸放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。5.实验中要注意节约药品与试剂，爱护仪器，使用前应了解使用方法，使用时要严格遵守操作规程，不得擅自移动实验仪器。否则，因非实验性损坏，由损坏者赔还。6.使用水、火、电时，要做到人在使用，人走关水、断电、熄火。7.做完实验要清洗仪器、器皿，并放回原位，擦净桌面。8.实验后，要及时完成实验报告。2006年1月2目录生物化学实验细则···································1目录··············································2实验1蛋白质的沉淀、变性反应······················3实验2醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白·············6实验3SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量···11实验4凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量·············16实验5DNA的琼脂糖凝胶电泳······················20实验6唾液淀粉酶的性质和活力测定·················24实验7生物氧化与电子传递·························25实验8植物体内的转氨基作用·······················273实验1蛋白质的沉淀、变性反应（3学时）目的要求1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。3.了解蛋白质变性与沉淀的关系。原理在水溶液中，蛋白质分子表面形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型：1．可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。2．不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。试剂和器材一、试剂1.蛋白质溶液：10ml/组取5ml鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤，新鲜配置。2.蛋白质氯化钠溶液：3ml/组取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。3.其余试剂：硫酸铵粉末（10克/组），饱和硫酸铵溶液(150ml)，3%硝酸银（280ml），0.5%乙酸铅（200ml），浓硫酸（5ml/组），5%磺基水杨酸（100ml），0.1%硫酸铜（100ml），饱和硫酸铜溶液（400ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），饱和氯化钠溶液（25ml），10%氢氧化钠溶液（500ml）。二、器材试管（15支/组），过滤漏斗（1个），试管架1个/组，玻璃棒1支/组，沸水浴4台，量筒4（总需要20ml×1,200ml×1），烧杯（总需要100ml×2，400×2），试剂瓶（12个/组，附胶头滴管10支/组），移液管（5ml×6/组，1ml×3/组），滤纸1盒，洗瓶1个/组，废液缸1个/组，药匙1个/组，移液管架1个/组操作方法一、蛋白质的可逆沉淀反应—蛋白质的盐析作用(分级盐析)3ml饱和硫酸铵过滤滤液球蛋白沉淀硫酸铵粉末搅拌至饱和静置混匀静置10min3ml蛋白质氯化钠溶液滤液清蛋白沉淀弃去清液水观察现象二、蛋白质的不可逆沉淀反应1.重金属沉淀蛋白质2.酸沉淀蛋白质1）2）10滴浓硫酸6滴蛋白质溶液观察两液界面不要摇动摇动试管观察现象3.加热沉淀蛋白质取5支试管，编号，按下表加入有关试剂（单位/滴）。蛋白质溶液0.1%乙酸10%乙酸饱和氯化钠10%氢氧化钠蒸馏水123451010101010—5—————55————2—————2722—5试剂管号5将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min，比较各管的沉淀情况。思考题1.名词解释：水化层；双电层；蛋白质变性；盐溶与盐析；蛋白质等电点沉淀。2.将实验结果写在实验报告中操作方法的对应位置上并就实验现象作简要解释。3.根据实验现象，讨论下列问题：1）蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？2）简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。4.作为杀菌剂，氯化汞是怎样起作用的？6实验2醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白（4学时）目的要求1.学习蛋白质电泳的一般原理及方法。2.掌握用醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白质的操作技术。原理带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。带电颗粒之所以能在电场中向一定的方向移动，并具有一定的迁移速度，是取决于带电颗粒本身性质的影响，以及电场强度、溶液的pH值、离子强度及电渗等因素的影响。蛋白质具有两性性质，在溶液中可解离的基团除肽链末端的α—氨基和α—羧基外，还有很多侧链基团在一定的pH条件下能解离而使蛋白质带电。当溶液的pHpI（等电点）时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，而的pHpI时，则带正电荷，电泳时向负极移动。由于蛋白质分子在溶液中解离成带电的颗粒，所以在电场中除等电点外均能定向泳动，其电泳的方向和速度主要决定于所带电荷的性质，以及所带电荷数量、颗粒大小和形状。不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用迁移率来表示。迁移率的定义是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。其计算公式如下：式中：m为迁移率（cm2/V·s）；v为颗粒的泳动速度（cm/s）；E为电场强度（V/cm）；ｄ为颗粒泳动的距离（cm）；ｌ为支持物的有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为电泳时间（s）。各种蛋白质的等电点、分子量及颗粒大小各不相同，在某一指定的pH值溶液中，各种蛋白质所带的电荷不同，因而在电场中迁移的方向和速度不同。根据这个原理，就可以从蛋白质混合物中将各种蛋白质分离出来。因此，电泳技术在生物化学与分子生物学研究中被广泛用于生物大分子或小分子（如蛋白质、核酸、氨基酸等）的分离纯化与分析鉴定等。同时此项技术也普遍用于临床诊断和工农业生产实践中，并已发展成为这些部门的重要分析分离手段。醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持物的一种区带电泳。这种薄膜具有均一的泡沫状结构，厚度为120μm，渗透性强，对样品无吸附作用，用它作支持物进行电泳，电泳效果比纸电泳好，具有样品用量少，分离速度快，电泳图谱更为清晰，灵敏度也较高（5μg/ml以上）等优点。目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定等方面。本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同（如图2-1），在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性pH缓冲体系中、带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1，α2，β-及γ-球蛋白（如图2-2）。这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。7蛋白质名称等电点（pI）分子量清蛋白α-球蛋白β-球蛋白γ-球蛋白4.885.065.126.85——7.5069000α1-200000α2-30000090000——150000156000——300000图2-1人血清中5种蛋白质的等电点及分子量图2-2正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1为清蛋白（或称为白蛋白），2、3、4、5分别为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白，6为点样原点试剂和器材一、测试材料未溶血的人或动物血清。二、试剂1.巴比妥—巴比妥钠缓冲液（PH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，备用。2.染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml，混匀溶解后置具塞试剂瓶内贮存。3.漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50ml，混匀置具塞试剂瓶内贮存。4.透明液：临用前制备。甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。5.保存液：液体石蜡。6.定量洗脱液（0.4mol/LNaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。三、器材醋酸纤维素薄膜（2×8cm），培养皿（直径9—10cm），解剖镊子，点样器，直尺和铅笔，电泳仪及电泳槽，玻璃板（12×12cm），试管及试管架，吸量管（2ml，5ml），吹风机，普通滤纸。8操作方法一、薄膜与仪器的准备1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择用镊子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15—30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜不均匀应弃去，以免影响电泳结果。将选好的薄膜用镊子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后，方可用于电泳。2.电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两各膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端侵入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。3.电极槽的平衡用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15—20min，注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。二、点样1.制备点样模板取一张干净滤纸（10×10cm），在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。2.点样用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间轻轻按压，吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。点样时，先用玻片一端截面沾取一定量的血清，然后将沾有样品的玻片截面垂直地与纤维素薄膜点样区处轻轻接触，样品即呈一条线“印”在薄膜上，（如图2-3