农推-林业生物技术-基因工程

第二章林木基因工程本章要点•2.1基因工程的基本知识•2.2植物基因的分离克隆•2.3植物遗传转化•2.4基因工程与林木遗传改良2.1基因工程的基本知识•基因工程–遗传工程，重组DNA技术(DNArecombination)–是指采用分子生物学手段，将不同来源的基因，按照人类的愿望，在体外进行重组，然后将重组的基因导入受体细胞，使原有生物产生新的遗传特性，获得新品种，生产新产品的技术科学。–可以跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因导入到新的生物中，实现不同生物的基因重组或基因转移，达到对某种生物个别性状遗传改良的目的。–是现代生物技术的核心和支柱。基因组–某种生物体或一个细胞所携带的全部DNA序列的总和。–狭义的基因组（genome）是专指核基因组。–广义的基因组还包括叶绿体基因组和线粒体基因组。核基因组–是指维持生物体完整生命功能所必须的1组染色体或配子体（性细胞）所包含的全部DNA序列（nDNA）。–一个生物物种单倍体基因组的DNA含量称为该物种的C值，每一个生物物种的C值是恒定的，一般用pg或碱基对表示。1pg=10-12g，相当于31cm长的DNA排列，约109bp。叶绿体基因组–叶绿体是植物进行光合作用的场所，–叶绿体中含有独立于核基因组以外的叶绿体基因组，称为cpDNA。–一个植物叶片细胞通常含有数百个叶绿体，–一个叶绿体中含20-80个cpDNA拷贝。–银杏的叶绿体基因组为158kb。线粒体基因组–线粒体是动植物细胞将有机物质氧化降解成水和二氧化碳、并释放出能量的细胞器。–也含有独立于核基因组以外的基因组，称为线粒体基因组，其DNA称为线粒体基因组DNA（mtDNA）。–植物的线粒体基因组比动物要大得多。–植物线粒体基因组含有数目不等的内含子序列。基因•指编码功能蛋白质或RNA分子所必须的DNA序列或RNA序列，是遗传的功能单位，可产生或影响某种表型。•一般又可分为–结构基因(structuregene)：编码蛋白质（或RNA）–调控基因(controlgene)：调控结构基因的表达。•通常指结构基因。真核基因的结构2.2目的基因的克隆•2.2.1基因克隆的工具酶•2.2.2基因克隆的载体•2.2.3基因克隆的方法2.2.1基因克隆的工具酶•限制性内切核酸酶restrictionendonuclease•DNA连接酶DNAligase•DNA聚合酶DNApolymerase•反转录酶•碱性磷酸酶•S1核酸酶•末端脱氧核苷酸转移酶2.2.1.1限制性内切核酸酶•限制作用：一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA（如噬菌体DNA），使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。•修饰作用：生物细胞自身的DNA分子通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置发生了甲基化，而得到修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。2.2.1.1限制性内切核酸酶•主要有I型、Ⅱ型、Ⅲ型。•Ⅱ型运用最广泛，I型和Ⅲ型应用极少。•I型目前发现的只有EcoB和EcoK两种，•Ⅲ型目前已知的主要是EcoPI和EcoP15。(1)Ⅱ型限制性内切核酸酶的特点①能够识别特异性的DNA识别位点，这种识别位点通常具有双链回文对称的结构；②切割后形成的双链DNA分子能够彼此互补，并能够重新连接；③切割和修饰功能由两种不同的酶催化完成；④切割不需要ATP和SAM（硫腺苷甲硫苷酸）作为活性催化因子。（2）命名和分类①利用属名的第1个字母和种名的前2个字母代表内切酶的来源。例如，来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的内切酶用Eco来命名，来自流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）的用Hin表示。②第4个字母表示酶来源的菌株和菌型。例如，EcoRI中的R表示该酶来自大肠杆菌的R菌株。③在同一菌株分离获得的不同内切酶按照分离时间的先后，以罗马数字加以标注，如HindI、HindⅡ、HindⅢ。（3）影响因素①DNA的浓度和质量----最关键的因素。②酶切消化的缓冲液。③酶切反应的温度。④其它因素。（4）应用①构建重组的DNA分子。②探针准备。③DNA物理图谱构建。④DNA甲基化分析。2.2.1.2DNA聚合酶•作用：将脱氧核糖核酸连续地连接到双链DNA分子的3´-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，形成长链的核酸分子。(1)大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow酶大肠杆菌DNA聚合酶I的作用：①DNA缺口平移，制备DNA探针。②用于DNA序列分析。•Klenow酶的主要用途：①DNA放射性标记。②合成cDNA的第2链。③补平内切酶切割双链DNA分子形成的粘性末端。④DNA测序。（2）T4DNA聚合酶•具有5＇→3＇DNA聚合活性和3＇→5＇外切核酸酶活性。其3＇→5＇外切核酸酶活性比Klenow酶强200倍。•主要作用：–限制性内切酶的末端补平；–标记探针；–切平双链的DNA末端。（3）T7DNA聚合酶•持续合成能力强，催化合成的DNA片段比其它聚合酶催化合成的长得多。•具有很强的3‘→5’外切核酸酶活性，为Klenow酶的1000倍。•主要用于长片段DNA的合成，也用于DNA分子的快速末端标记。•测序酶：经过修饰，失去了3＇→5＇外切核酸酶活性的T7DNA聚合酶。（4）TaqDNA聚合酶•从极度嗜热的嗜热水生菌Thermusaquaticus中获得，能在94℃高温环境中存活3小时以上。•具有DNA聚合酶活性和5‘→3’外切核酸酶活性。•最佳聚合温度在72～80℃。•常用于PCR(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)扩增。（4）TaqDNA聚合酶影响TaqDNA聚合酶扩增反应的主要因素：–①模板DNA浓度。25μl的反应体系中10～50ng双链DNA。–②引物结构及浓度。引物长度一般10～30bp，一对引物扩增的片段在200～3000bp。引物浓度10～50mmol/L。–③Mg2＋浓度。1.5～2.5mmol/L。–④退火温度。因引物而异，一般引物50～60℃最佳。–⑤缓冲液；–⑥TaqDNA聚合酶的浓度和用量。（5）RNA反转录酶•以RNA单链为模板，通过DNA聚合作用形成复合双链cDNA。•目前主要有2种，AMV和M-MLV，均无3＇→5＇外切核酸酶活性。（6）DNA连接酶、RNA连接酶•DNA连接酶连接双链DNA。•已知的有2种（大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶）。前者需要NAD＋参与催化，不需要ATP作为能量；后者同时需要NAD＋与ATP。二者可催化粘性末端及平末端的连接反应。不能催化单链DNA的连接。•单链DNA或RNA的连接可使用T4RNA连接酶。（7）其它酶类•末端转移酶、碱性磷酸化酶、S1核酸酶、BAL31核酸酶、核糖核酸酶A、脱氧核糖核酸酶I、外切核酸酶Ⅲ，等等。•末端转移酶:将脱氧核糖核酸分子按照5＇→3＇方向逐个加入到线性DNA分子末端的一种酶类。用途：①同聚物加尾；②3＇末端标记。•碱性磷酸化酶:将5＇末端的磷酸基团转换为OH，即脱磷酸作用。2.2.2基因克隆的载体•载体(vector)：在基因工程中，用于携带外源基因进入受体细胞的运载工具。载体本身是DNA。载体的基本条件：①含有1个或多个克隆位点，供外源DNA片段的插入到载体上。②能进行自我复制，或外源DNA片段能够整合到染色体上，随染色体而进行复制。③具有选择标记。④安全，对受体细胞无害。⑤分子量小，多拷贝，易于操作。2.2.2基因克隆的载体•载体种类：–质粒载体–噬菌体载体（包括以噬菌体和质粒为基础构建的Cosmid载体）–人工染色体载体（YAC、BAC、PAC、TAC）(1)质粒载体•质粒是存在于宿主细胞染色体外的一种裸露的双链DNA分子。多呈闭合环状，也有例外。•商业化的质粒载体一般3～5kb长。目前已有上百种，如常用的pUC18/19。(2)λ噬菌体载体•λ噬菌体是以大肠杆菌为宿主的病毒，具有极高的感染能力，能够专一性的重组整合到大肠杆菌的染色体上，以原噬菌体的形式长期潜伏在大肠杆菌中。•λ噬菌体载体实际可插入的片段长度可达20kb。主要用于cDNA文库构建。(3)Cosmid载体•结合了λ噬菌体载体和大肠杆菌质粒载体的优点，本身片段小，但装载能力大，可插入15-45kb，•可用于基因组文库的构建。(4)噬菌粒(Phagemid)载体•也是在λ噬菌体载体和大肠杆菌质粒载体基础上发展起来的。•与Cosmid载体有许多相似之处，如分子量更小。(5)人工染色体载体•酵母人工染色体（YAC，yeastartificialchromosome），最大优点是能够插入较大的外源片段，可达2000kb。•细菌人工染色体（BAC），穿梭细菌人工染色体（BIBAC）。•P1人工染色体（PAC），可转基因人工染色体（TAC）。不同类型载体比较2.2.3基因克隆的方法•2.2.3.1基因文库构建与基因克隆•2.2.3.2已知基因产物的基因克隆•2.2.3.3图位克隆•2.2.3.4差示克隆2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆（1）基因文库的概念–基因文库（genelibrary）：某生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。–某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落(或噬菌斑，或成活细胞)即为一个DNA片段的克隆。–全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆•构建基因文库的意义：–①使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来。–②是分离克隆目的基因的主要途径。–③对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小。要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。–④在很多情况下目的基因的分离都离不开基因文库。–⑤基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆（2）基因组文库与cDNA文库–基因组文库：将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。根据DNA来源，又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。–cDNA文库：某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。–区别：cDNA文库有时效性。2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆（3）构建基因文库的基本程序-①植物DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。-②载体的选择及制备。-③DNA片段或cDNA与载体连接。-④重组体转化宿主细胞。-⑤转化细胞的筛选。2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆（4）基因组文库必须符合以下要求：–a）能够覆盖整个基因组。–b）插入的片段比较大。–c）文库比较稳定，且易于保存和操作。2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆（5）植物cDNA文库构建–克隆载体：主要是质粒及λ噬菌体。–步骤：•①细胞总RNA提取，并分离纯化出mRNA；•②合成cDNA第一链；•③将mRNA-DNA杂交分子转变成双链cDNA；•④双链cDNA重组到载体上。•前3步为cDNA合成，第④步为cDNA克隆。用插入型λ噬菌体载体构建cDNA文库的流程2.2.3.1基因文库的构建与基因克隆（6）基因文库筛选方法–①核酸杂交法；–②免疫学检测法；–③DNA同胞选择法；–④PCR筛选法；–⑤其他方法。2.2.3.2已知基因产物的基因克隆•以氨基酸序列为基础的基因克隆方法是最为经典的方法。•通过对表达的或者差异表达的蛋白质分子的序列进行测定分析，获得该蛋白质的一段氨基酸的序列。根据编码不同氨基酸的密码子设计出一条简并引物，利用这条引物进行RT-PCR或RACE-PCR扩增，克隆基因的全长。2.2.3.2已知基因产物的基因克隆•此外，在进化过程中，蛋白质编码的氨基酸存在着保守区段，这些保守区段在不同生物种、属间，甚至不同门类之间存在着高度的同源性。•如果在某一种生物体中该基因已经被克隆，也可以利用这些保守区段的核苷酸为探针来筛选cDNA文库。或者利用这个引物与基因的5＇和3＇端的特殊引物配对，进行RACE-