《环境毒理学概论》实验教案

《环境毒理学概论》实验教案孟庆俊，张明青中国矿业大学环境与测绘学院2008．31实验一鱼类回避试验一目的与要求1．学习鱼类回避反应的生物学机理；了解回避装置的结构，设计原理及使用方法；掌握回避试验的操作步骤及试验结果的计算和分析。2．实验前要求学生预习实验指导书的内容，对整个实验过程要熟悉，要有整体概念，充分理解实验原理。二实验的组织安排1．由于学生人数较多，本实验共分两次进行，即每次一个班，每班分4组。2．进入实验室后，先由教师对实验的原理等内容进行讲解，告之实验已准备的相关内容、学生要做的主要工作，以及实验中应请注意的有关事项。然后才能按部就班地进行实验。三实验原理鱼类回避反应属于行为毒理学的研究范畴，它阐明水生动物对污染物是否回避，及其引起回避的浓度，以期对水体污染进行早期预报，并为制定和评价渔业水质标准提供重要依据。本试验以鱼为试验动物进行回避试验。鱼类的嗅觉、味觉、视觉、和侧线等感受器对环境刺激具有保护性的本能反应，即回避反应。利用鱼类对受污染水产生回避反应的特点，认为世界污染水区和非污染水区的迷宫回避装置，给鱼以污染物刺激，鱼能主动躲避污染水区，迅速游向清洁水区，据此观察污染物对鱼的回避行为影响。四实验准备（一）器材与试剂按照实验指导书准备相关实验器材，主要是Y型回避装置，并配制相关化学试剂。（二）实验生物从市场提前一周购买实验用鱼，可以是当地可以见的任何一种鱼，但不应过大，体长在4cm左右即可，在实验室内驯养，以备实验所用。五步骤和方法（一）预备试验这部分内容由实验教师在学生的正式实验前来完成，主要的目的是确定实验浓度范围。具体的步骤如下：21.按鱼类急性毒性试验方法，求出待测物的96hLC50值。本实验以资料中查得的96hLC50值为参考。鱼类对铜是非常敏感的，因此实验所选的受试化合物为硫酸铜。2.选用不同的鱼种，以1/2和1/1096hLC50为试验浓度，进行探索性的回避试验，确定试验用敏感鱼种和试验浓度范围。3.调节供水系统的流量4.用2~4支20L的下口瓶构成可调的自供水系统。以活动夹调节水流速度，用液体流量计测量水流量，使水流量为200~400ml/min。（三）回避试验步骤1.试验槽全部注入清洁水，将试验鱼（1~10尾）移入槽中，让其在槽内适应15~30min。2.关闭供排水系统，将试验鱼全部驱入混合区，配置所需浓度的待测物。3.观察于记录目测计数，观察污染物对鱼的回避行为的影响，打开供排水系统，移去隔板，每分钟（或每30s）监视和记录一次进入清洁区和污染区的鱼数。历时20~30min。重复四次，每次试验结束后，以清水洗净试验槽，间隔15min后，再行重复试验（即每一试验浓度重复四次，即两槽各注入待测液，二次清洁水）。然后更换待测物的浓度。六结果和报告实验结果后一周内要把实验报告交至实验室，报告书中要重点写明实验的原始数据、实验数据的处理过程与结果，实验结论与讨论等内容，字迹清楚，条理分明。七注意事项1．试验鱼需预先在实验室条件下驯养一周，且为健康鱼种。2．必须保持实验室环境的安静，有恒定的温度和均一的光照条件。3．严格控制槽中清洁水和试验待测溶液的流速。4．试验应按由低浓度到高浓度的顺序进行。每个浓度试验结束后在更换浓度试验时，都必须用清水洗净回避装置。5．当待测物浓度低时，须先配成母液备用。6．如待测物易挥发，试验时应在回避装置上加盖，以免挥发，影响试验液浓度。7．记录时，进入回避槽混合区的鱼，不予记录和计算。3实验二污染区沉积物对水生动物的急性毒性试验（鱼类急性毒性试验）0.0028-2.8mg/L一目的与要求1．通过本实验，熟悉和掌握急性毒性试验的设计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析和报告等全过程。2．做好实验预习工作。二实验的组织安排1．实验生物的准备及相关的预实验由实验室教师来完成。2．学生实验分两次进行，一次一个班，每班分10个组。3．进入实验后，先由教师简单讲解实验原理、过程与注意事项，并说明实验生物的准备与驯养过程。然后再开始正式的实验。三实验原理鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。在规定条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行24小时，最好以96小时为一个实验周期，在24、48、72、96小时时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50%时的受试物的浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占有重要地位。考虑到污染沉积物的取样难度，本实验采用金属铜作为受试物，测定其对鱼类的急性毒性。四实验准备1．实验鱼的选择与驯养试验用的鱼必须对毒物敏感，具有一定的代表性，便于实验条件下饲养，来源丰富，个体健康，我国可采用的试验鱼有四大养殖淡水鱼(青鱼、草鱼、鲢鱼和鳙鱼)、金鱼、鲫鱼等。本实验选用草鱼作为实验鱼。选用的试验鱼在试验前必须在实验室内以过驯养，使这适应实验室条件的生活环境，至少驯养7天。驯养期间应每天换水，喂食1~2次，但在试验前一天应停止喂食，以免影响实验结果。驯养期间试验鱼死亡率不得超过5%。2．实验仪器设备相关玻璃器皿。主要是1L的玻璃烧杯。4五操作步骤1．预实验用于确定正式实验所需浓度范围，由实验教师在学生正式实验前完成。2．正式实验:根据预实验的结果，在包括使鱼全部死亡的最低浓度和96h鱼类全部存活的浓度之间至少设置5个浓度组，并以几何级数排布。每个浓度组至少设2~3个平行，每一个系列设一个空白对照。试验鱼的数目以每组实验浓度10~20尾合适.在24h、48h、72h、96h后检查受试鱼的状况。如果没有任何肉眼可见的运动即可判断鱼已死亡。观察并记录死鱼数目后，将死鱼从容器中取出。试验结束时，对照组的死亡率不得超过10%。六实验报告1．数据处理计算出24h、48h、72h、96h的半致死浓度(LC50)值，并计算95%的置信限。依据LC50值的大小和下表标准，确定铜对鱼的急性毒性分级。鱼LC50值(mg/L)11~100100~10001000~1000010000毒性分级剧毒高毒中等毒低毒微毒2．编写报告在实验报告中应包括试验名称、目的、试验原理、试验的准确起止日期。还有如下几项：(1)试验鱼的种名、来源、体重、体长、健康和驯化状况。(2)受试物质的名称、来源、物化性质和保存方法。(3)实验用水的来源、物化性质和实验前的处理等。(4)实验溶液的浓度与配置方法、实验温度。(5)实验条件(6)实验开始后24h、48h、72h、96h的半致死浓度(LC50)值，及其毒性分级。(7)实验结果讨论等。七注意事项1．生物材料选择上应尽可能选择敏感种，其年龄，大小应尽量一致。2．试验期间，对照组鱼死亡率不得超过10%。3．试验宜在控温室中进行，并保持一定的光强度。5实验三重金属对鱼肝过氧化氢酶的影响一目的与要求学习应用生物化学方法研究污染水体中重金属对鱼类的影响，掌握生物监测的一个测试手段。二实验的组织安排1．实验前由实验室内的教师准备购买实验用鱼、进行室内染毒处理及相关器皿和化学试剂的准备。2．两个班同时进行实验，4-6人一个小组。但由于实验历时较长，操作较复杂，要求安排时间上要找整块的时间，如一个下午。三原理过氧化氢酶普遍存在于动物、植物和微生物细胞中。它催化分解细胞代谢产生的H2O2和还原某些其他氧化物。在调节细胞免于死亡过程中其重要作用。过氧化氢每含有丰富的疏基，重金属可与酶的疏基活其他活性基团相互作用，从而改变酶的活性，呈现致毒作用。过氧化氢酶催化分解H2O2，以H2O2消耗量来表示过氧化氢酶的活力。酶活力测定原理如下：2H2O2过氧化氢酶O2+2H2O剩余的H2O2用碘量法定量测定：H2O2+2KI+H2SO4→I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O3→2NaI+Na2S4O6四设备与材料（一）设备1玻璃匀浆机；2解剖器具；3普通台式分离机；4定时钟；5恒温水浴；6滴定管（10ml，酸式）；7碘量瓶（100ml）。（二）试剂1）0.5mol/LH2SO4；2）10%KI；63）0.01g/LNa2S2O3；4）0.01mol/L，PH6.8磷酸缓冲液：A称取1.3610g的KH2PO4溶至1000ml，B称取3.5816g的Na2HPO4溶至1000ml，取A与B大致同体积配成PH6.8的磷酸缓冲液；5）H2O2磷酸缓冲液：取1ml30%的H2O2试液，用0.01mol/L，PH6.8磷酸缓冲液稀释至1000ml；6）淀粉指示剂：取0.3g可溶性淀粉，以少量冷蒸馏水拌匀，倒入沸水中，冷却后，加入0.1g的Na2CO3，用蒸馏水稀释至50ml；7）1%鉬酸铵溶液；8）0.25mol/L蔗糖溶液。（三）实验材料处理测定重金属离子对鱼96hLC50值，再以1/2~1/6LC50浓度的重金属离子试液，将实验用鱼在试液中暴露96h。五步骤和方法（一）酶匀浆制备将处理后的鱼杀死，剥离肝脏，用滤纸吸干，称重，按1:10（W/V）加入1~4℃冷0.25mol/L蔗糖液，匀浆，以1500r/min离心5min，取上清液，用0.25mol/L蔗糖稀释20倍，置于1~4℃环境中，供测定酶活力使用。（二）过氧化氢酶活力测定过氧化氢酶活力测定操作程序表测定组试剂试剂空白组处理组对照组0.01mol/LPH6.8H2O2磷酸缓冲液5ml5ml5ml25℃水浴中恒温1分钟2ml0.5mol/LH2SO41ml酶液1ml酶液25℃水浴中准确保温3分钟（混匀）1ml酶液2ml0.5mol/LH2SO4(破坏酶活性)2ml0.5mol/LH2SO410%KI0.5ml0.5ml0.5ml1%钼酸铵1滴1滴1滴混匀后放置3分钟，用0.01g/LNa2S2O3滴定，达浅黄色时，加淀粉2~3滴，滴定至蓝色消失。7六结果和报告（一）过氧化氢酶活力以单位时间酶促分解H2O2的微克分子数表示。计算公式如下：酶活力=321000Nf)A(或BCA——处理组样品消耗的Na2S2O3（ml）。B——对照组样品消耗的Na2S2O3（ml）。C——试剂空白消耗的Na2S2O3（ml）。3——反应时间3分钟。2——消耗2个分子的Na2S2O3相当于1个分子的H2O2。F——酶液的稀释倍数，本实验为200。N——Na2S2O3的当量浓度（g/L）。1000——毫克分子换算成微克分子的放大倍数。（二）过氧化氢酶实验记录表格试剂空白（C）处理组（A）对照组（B）123123456123456消耗的Na2S2O3（ml）fN(g/L)酶活力说明记录人__________七注意事项1．实验用鱼应选择规格相近的同种同龄鱼。2．测定过氧化氢酶活力的鱼样品数不得少于6条。3．整个酶活力测定操作过程应在低于25℃室温下进行。酶促反应必须在25℃恒温下进行。4．酶促反应时间必须计时准确。5．滴定消耗0.01g/L的Na2S2O3在6ml左右为合适。超过或低于此值，应调8节稀释倍数。6．实验记录表中，“酶活力”以下的记录项目，只对处理组和对照组适用。“说明”一栏可记录中毒试剂的浓度，或其他相应的实验条件，以及在实验中出现的意外情况。实验四氟化物对植物的静态熏气染毒试验9一目的与要求通过试验掌握气态污染物对植物毒性的染毒过程与方法，观察大气中氟化氢对典型植物的毒害症状。二实验的组织安排1．实验前学生根据植物对氟化氢的敏感程度，在校园里自己采集植物样本。其它仪器与试剂的准备由实验室教师完成。2．两个班同时进行实验，4-6人一个小组。三实验原理随着我国经济的发展，工业、农业生产、日常生活和交通运输向大气中排放的污染物的数量和种类日益增加，这些大气污染物直接或间接危害着植物。其中大气中氟化物污染造成的危害情况日趋严重，目前，酸雨、温室效应和臭氧层的破坏是现在世界范围内的三大问题，而大气中的氟化物与这三个问题都密切相关，有关大气中氟化物污染方面的研究也成为当前环境科学研究的重要内容，引起了人们的广泛重视。通常情况下植物体内也含有一定量的氟，但当植物体内氟含量超过植物所能承受的量时植物就会受到伤害。