医学微生物学实验指导

医学微生物学实验指导皖南医学院微生物学和免疫学教研室2006年5月微生物学实验的目的与要求医学微生物学的实验课是本课程学习中的重要环节。医学微生物学实验课的目的：在于使学生加深和巩固对讲课内容的理解和体会，并在系统学习理论的基础上，使学生学习并掌握微生物学的基本操作技术，培养独立思考的能力，为今后的临床实践及科学研究工作打下良好的基础。为了提高实验课的效果，应做到以下几点：一、每次实验前作好预习，明确实验目的，内容，操作中注意点及其理论依据，避免或减少错误发生。二、在实验过程中，应持严肃认真的科学态度，并要注意合理地分配和利用时间。三、在微生物学的整个实验过程中，应严格加强“无菌观念”的培养和训练。四、实验结果须真实记录，进行分析，得出结论。如实验结果与理论不符，应探讨原因，训练科学思维的能力。实验完成后，要写出实验报告。微生物学实验室规则微生物学实验的对象大多是病原微生物，因此必须严格贯彻“无菌观念”，防止实验中自身感染和环境污染是微生物学实验室的最重要原则。一、尽量不带个人生活、学习用品入实验室，必要的用具带入后，应放在远离操作的位置。二、进入实验室后穿上工作衣，离室时脱下反叠带走。在实验室内应保持安静、整洁、有秩序，不得高声谈笑，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。三、实验室内严禁吸烟、进食、饮水，严禁用嘴吸移液及润湿标签，尽量不要用手触摸头面部及身体其他暴露部位。四、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情况，应立即报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。五、被污染过且需要回收的吸管、滴管、试管、玻片等物应用完后立即投入已准备的消毒液中，不得放在桌面上或水槽内。六、爱护公物，节约试剂材料，不得将实验室任何物品私自带走。如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。七、实验完毕，整理桌面，值日生打扫室内卫生，最后离开的同学应注意关好水电、门窗，洗手后离室。实验一自然界与人体的微生物检查实验目的：了解微生物在空气、物体表面及正常机体表面的分布，增强消毒及无菌操作的观念。实验材料：普通琼脂平板、无菌棉棒、无菌生理盐水、蜡笔、酒精灯。实验内容：一、空气中微生物的检查：取无菌普通琼脂平板一只，打开后暴露在空气中，30分钟后盖好，置37℃温箱孵育24小时，观察各种菌落的特征。二、皮肤、粘膜及其它物品表面微生物的检查：取普通琼脂平板一只，用蜡笔在皿底玻璃上划分四区，将标签纸贴于正中，分别注明皮肤、粘膜、硬币或钢笔等字样。然后反转，打开平板：1、用手指在注明“皮肤”处琼脂上轻轻擦拭。2、把沾取了无菌生理盐水的湿棉棒在管壁上挤干水，擦拭咽部或鼻腔粘膜，然后轻轻抹在“粘膜”处琼脂上。3、分别取硬币或钢笔等物在相应区域内抹擦。盖好平板，置37℃温箱内孵育24小时后，观察菌落的生长情况。实验报告：观察与记录结果。实验二油镜的使用实验目的：熟悉显微镜的使用方法。实验材料：标本片、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯。实验原理：使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰。D’C’B’A’油空气玻璃空气ABCD图1油镜的原理示意图实验方法：1、用油镜时，勿将镜臂弯曲倾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，影响观察造成污染。2、用低倍镜对光，自然光线用平面镜（光源不宜采用直射日光，因直射日光的强度太大容易刺激眼睛），人工光源用凹面镜，同时调节集光器和光圈以获得最适亮度。染色标本油镜检查时，应将光圈完全打开，集光器上升至载物台相平，使光亮度很强。3、标本片放在载物台上，用标本推进器或压片夹固定。4、低倍镜找出标本的范围，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置，从侧面观察并缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调节器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调节器转动至物象完全清晰为止。5、观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。若油已干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。6、显微镜擦净后，降低物镜并将其转成八字形，集光器下降，反光镜推平，光圈关上，归还显微镜室。实验三细菌的基本形态和特殊结构实验目的：掌握细菌的基本形态和特殊结构。材料及方法：一、细菌的基本形态（示教）1、球菌：葡萄球菌，革兰氏染色阳性。2、杆菌：大肠杆菌，革兰氏染色阴性。3、弧菌：霍乱弧菌，革兰氏染色阴性。二、细菌的特殊结构（示教）1、荚膜：肺炎球菌，成双排列，菌体四周不着色的透明圈即是荚膜所在处。经荚膜染色后，菌体与背景呈现紫色，荚膜为无色。2、鞭毛：伤寒杆菌，菌体四周有周鞭毛。经鞭毛染色后，菌体和周鞭毛均呈紫色。3、芽胞：破伤风杆菌，菌体细长，顶端可见一正圆形芽胞。经芽胞染色后，菌体为蓝色，芽胞为红色。实验报告：1、绘图说明各种形态细菌的大小、形态、排列方式，并注明染色性及放大倍数。2、绘图说明细菌的特殊结构，并注明染色性及放大倍数。实验四基础培养基的制备培养基是根据微生物生长繁殖时对营养物质的需要而配制的营养制品，含有营养物质及适宜的酸碱度，经灭菌后使用。常用的培养基按用途分为：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基及厌氧培养基。按物理性状分为固体、半固体和液体三种。实验目的：了解常用的液体、固体、半固体培养基的成分、制备方法和用途。实验材料：牛肉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、0.1mol/lNaOH溶液、酚红指示剂、蒸馏水等。实验方法：一、肉汤培养基1、将鲜牛肉除去筋膜和脂肪，切成小块后用绞肉机绞碎，以每500g碎牛肉加1000ml蒸馏水的比例混合后，置4℃冰箱过夜。2、次日取出浸泡物倒入容器内煮沸半小时，使肉渣凝固，也可煮沸一小时不经冰箱过夜。3、用纱布和脱脂棉过滤，除去肉渣，即成肉浸汁。加入1%蛋白胨及0.5%氯化钠，加热溶解并用蒸馏水补足蒸发失去的水分。4、待冷至50℃左右时，调该溶液的pH至7.4~7.6。校正pH的方法为：①取三支与标准比色管（pH7.6）相同的空比色管，其中一管内盛放蒸馏水5ml；另外两管各加入欲测的肉汤培养基5ml，其中一管内加0.02%酚红指示剂0.25ml（滴定管），摇匀。②按图2所示排列，举起比色架，对光观察。若滴定管色调较淡或为黄色，即表示培养基偏酸性，需滴加0.1mol/LNaOH矫正；若呈深红色，即表示偏碱性，应滴加0.1mol/LHCl矫正；使之与标准比色管色泽相同为止。通常未矫正前的肉汤均呈酸性。记下用去的NaOH（或HCl）溶液量，由此计算出矫正全量培养基时所需NaOH（或HCl）溶液量。图2pH比色架5、酸碱度矫正后，加热煮沸10分钟，用滤纸过滤，补足水分，再调一次pH值。6、分装肉汤于三角烧瓶或试管，瓶口、管口加棉塞并用纸包扎。7、置高压灭菌器内103.43Kpa20分钟灭菌备用。可用市售的牛肉膏代替牛肉，用量为0.3%，其余成分相同（如蛋白胨、氯化钠等）加热溶解，调节pH至7.6左右，煮沸10分钟，补充失水、过滤、分装，灭菌后备用。二、固体培养基1、在上述制备的肉汤中加入2-3%的琼脂。琼脂为海藻中提取的一种多糖类物质，本身无营养作用，不能被细菌利用。因其加热到100℃后可溶化，冷却至40℃左右又可凝固，故可作为赋形剂。加热溶化，脱脂棉过滤，补足失水，分装三角烧瓶和试管。2、置高压灭菌器内103.43Kpa灭菌20分钟，取出后趁热将试管倾斜一定角度放置，待琼脂凝固即成琼脂斜面培养基（图3）。三角烧瓶内培养基冷至50-60℃时在超净台或无菌室内将其倾注于灭菌平皿内（15-20ml），凝固后即成琼脂平板。图3琼脂斜面培养基另外，实际工作中现多使用合成营养琼脂干燥粉末制剂。其方法为：称取41克营养琼脂干燥粉末加入1000ml冷蒸馏水中混合放置10分钟，隔石棉铁丝网微火煮沸使其完全溶解，分装于中试管中（约5~7ml）或三角烧瓶，103.43kPa（121℃）灭菌15分钟，即可备用。三、半固体培养基1、操作方法同固体培养基，但琼脂加入量较少，仅0.3-0.5%。2、分装试管，灭菌后使试管直立，冷凝后即成半固体培养基。实验五细菌的分离与培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。图4-1平板分区划线法图4-2培养后菌落分布情况二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。三、半固体穿刺接种法用途：观察细菌动力，保存菌种。方法：1、以无菌操作用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回。2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37℃温箱孵育18-24小时，取出后对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。图5液体（左）及半固体（右）培养基接种法四、斜面培养基接种法用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。操作方法：1、以无菌操作法用接种环挑取单个菌落，自斜面底向上划一直线，然后再从底向上轻轻来回作蜿蜒划线。2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。置37℃温箱孵育18-24小时，取出观察斜面上菌苔生长情况。图6斜面培养基接种法实验报告：详细记录细菌在各种培养基中生长后的表现。实验六病原性球菌的检查（一）实验目的：1．了解病原性球菌的检查程序。2．掌握细菌涂抹标本制备和革兰氏染色法。3．掌握病原性球菌的形态和分离培养法。实验材料：病原性球菌的形态、脓汁标本、革兰氏染色液、普通平板、血平板、玻片、接种环、酒精灯、光学显微镜、香柏油、吸水纸、擦镜纸、标记笔。实验内容：一、病原性球菌的检查程序病原性球菌常引起化脓性疾病，分离用标本多采用脓、痰液，但也可从分泌物、血液及穿刺液中取材。1、标本采集（1）脓液：用无菌棉拭挑取患部深处脓液或分泌物，放入无菌试管内。（2）痰液：用消毒过的容器收集病人痰液，以无菌棉拭挑取浓稠痰块，放入无菌试管。（3）咽部分泌物：嘱病人张开口，用压舌板