医学生物化学实验指导-第一章

第一章实验基本操作一、要求1．熟悉实验室规则及常用生化仪器2．清点洗刷实验用具。3．掌握各种仪器的正规操作及维护二、常用生化仪器烧杯试管刻度吸量管离心管滴管搅棒枪式移液器及其配适吸头混匀器恒温水浴箱离心机分光光度计，电泳仪点收仪器；根据仪器清单，逐项查点是否完好(如有缺损向教师声明及时补充更换)。本套仪器由本人使用保管至全部实验课程结束。三、基本操作1．玻璃仪器的洗涤(1)洗涤液：①洗洁精，肥皂水，洗衣粉。②玻璃仪器专用洗涤液：主要成份为中性稀氯氧化剂，上海日化研究所出品(2)洗涤的要求与步骤：要求：洁净的玻璃器皿表面应不挂任何水滴。步骤：不净的器皿洗衣粉或肥皂水刷洗自来水冲净达到要求？是浸入洗液(数小时至过夜)自来水冲净蒸馏水涮洗2—3次(其目的是去除自来水中的杂质，故应少量多次，全面充分)烤干或晾干、备用对使用过的仪器应养成及时清洗的习惯，特别是血液分析时用以吸取血液样本的吸管，用过后应当立即用水将所沾的血液冲去，否则放置过久，血液干燥硬结，就很不容易清除。(3)玻璃仪器的干燥一般的玻璃仪器均可洗净后倒置架上，让其水分蒸发自然干燥，如需迅速干燥者应按仪器的不同类型按下述不同方法处理：①试管、离心管、烧杯、烧瓶等普通玻璃器皿可置烤箱中100—105℃烘烤②少量仪器如需急用也可在电炉上或酒精灯上烘烤。烘烤时应将器皿时时转动，务使受热缓慢且均匀，并将管口(或杯口)倾斜向下，以便水蒸气冷凝成水滴，顺口流出，不致使水滴接触烘热了的器壁而使仪器爆裂。③使用电吹风干燥一般玻璃仪器也很便利常用。④下列玻璃仪器应避免烘烤：吸管：容易造成器壁变形而致容量不准。比色杯：易在烘烤时发生破裂。2．移液操作(1)吸量管的使用①吸量管的选择：在一次完成转移的前提下，应选用容量较小的吸量管。·对于同一次实验中同一种试剂的移取，应选用同一支吸量管②操作(见图1—1)·用洗耳球将液体吸至超过标线·移开洗耳球，迅速用食指压紧管口·必要时将管尖端外围拭净·调液面至标线·放开食指，使液体流入容器·将最后液滴沿器壁而下或吹出③读数(见图1—2)·吸量管保持垂直·视线与液面应水平·管中液面与刻度线应呈切线注：对于刻度由上至下的吸量管应尽量使用上端刻度管尖残液是否需吹出，看清标记。弯(2)枪式移液器的使用①抢式移液器的结构(见图3)1.液体吸放钮2．体积选取钮3.体积、显示4．枪头排放钮5.枪头排放器6．枪头接嘴其内部柱塞分2段行程，第1档为吸液，第2档为放液，手感十分清楚。②操作(见图1—4)·调体积选取钮至所需值·套上枪头，旋紧·垂直持握枪式移液器外壳，按下大拇指至第1档·将枪头插入溶液，徐徐松开大拇指，使其复原·排放时，重新将大拇指按下，至第1档后，继续按至第2档以排空注：移取过程中应控制速度，力度如需移取另一样品，按枪头排放钮，更换枪头3．混匀(1)旋转法：手持容器，使溶液作离心旋转(2)指弹法：一手执试管上端，另一手轻弹试管下部，：使其中液体作涡旋运动。(3)搅动法：使用玻璃棒搅边；多用于溶解烧杯中的固体。(4)混匀器法：将试管置于混匀器的振动盘上，逐渐用力下压，使内容物旋转。(5)倒转混匀：适用于具塞的容器，如容量瓶、具塞量筒及具塞离心管等。操作时，将容器反复倒转。试管内的液量太多，也可利用倒转混匀法，外面包以玻璃纸塞住管口，然后用手指按住橡皮塞将试管反复倒转，溶液即可充分混匀。(6)吸管混匀法：用吸管将溶液反复吸吹数次，以达到混匀的目的。4．加热与保温(1)加热(2)保温①使用恒温水浴箱，调节温度设定钮至需要的温度。②水浴箱中水要足量。③实验过程中应随时监测温度，并及时调节。5．离心(1)离心沉淀法：当颗粒小而不均一，沉淀粘稠或容积小又需精确定量时，往往采用离心沉降法。(2)离心前检查：①取出所有套管，起动空载的离心机，看是否转动平稳。②检查套管有无软垫，是否完好，内部有无异物。③离心管与套管是否匹配。(3)平衡：将一对离心管放入套管，置于天平两侧，用滴管较轻一侧的离心管与套管之间加水至两侧平衡(离心管及其内溶液量不能差别过大)(4)离心：将等重的两管置于离心机中的对称位置，调转速调节钮，逐渐增加转速至所需值，计时，离心结束后，将套管中的水倒净，所有套管放回离心机中。四、血液样品的制备：1．采取血液样品的注意事项：(1)空腹采血：血液中不少化学成份可受饮食影响，一般需在早晨空腹或禁食6小时以上采取血液。(2)防止酶的分解作用：血液内若干化学成份在离体后继续分解。如血糖被红细胞糖酵解酶系统分解而降低；为防止酶分解作用可用氟化钠、碘乙酸等保存剂，或将血液立即制成无蛋白血滤液。(3)防止溶血：红细胞与血浆中成分与含量皆有显著的差别，因此溶血可影响一些血清或血浆生化检验的结果。为防止溶血，抽血用具必须干燥清洁，避免剧烈振摇，防止污染。2．抗凝剂：根据所测定血液成份不同，标本可应用血清、血浆或全血。若需血浆或全血应加抗凝剂。(1)草酸钾为最常用的抗凝剂，0．2m8可使1nd血液不凝固。它与血液内钙离子形成草酸钙使血液不再凝固，但不能用于钾、钙测定。(2)草酸钾一草酸铵混合剂(3：2)铵盐使红细胞膨胀，钾盐使之皱缩，故两者混合能保持红细胞体积不变。(3)柠檬酸盐与钙离子混合成可溶性钠络合物，从而防止血液凝固。比草酸钾较少产生溶血，故用于红细胞沉降率测定及输血。但抗凝能力较弱，一般不作生化检验抗凝剂用。(4)氟化钠有弱抗凝作用，但能抑制糖酵解和一些水解酶类。草酸钾--氟化钠(3：1)、氟化钠--麝香草酚(10：1)是测定血糖、尿酸、肌酐、无机磷等的良好抗凝剂。(5)肝素能抑制凝血酶原转化为凝血酶而抗凝血。抗凝能力强，0．1—0．2mg或20单位可使1m1血液不凝固，且较少产生溶血。五、实验预习，实验记录，实验报告1．实验预习实验前应认真预习，弄清实验目的、原理、操作概要、各步操作的意义及注意事项。2．实验记录准备一个记录本，在实验时记录实验现象、实验结果和实验数据。3.实验报告每个同学均应准备一个练习本，以备实验结束后及时整理和总结实验结果，写出实验报告：实验报告应包括以下项目：(1)实验名称(2)目的和要求(3)原理(简述实验的基本原理)(4)操作(可以采用流程图的方式或以表格方式表示)(5)结果与讨论描述实验出现的现象和结果，分析它们所说明的问题，探讨实验成败的关键。阐述对实验设计的改进意见等。对于定量实验列出算式进行计算并对实验结果进行必要的说明和分析。(6)思考题(徐洪)第二章生物化学实验常用方法第一节分光光度法光线的本质是一种电磁波，有与电磁波和X线类同的性质。光线有不同的波长，肉眼可见彩色光称之可见光，波长范围在400—750nm，小于400nm的光线称为紫外线，大于750nm的光线称之红外线。如图所示(表2—1)当光线通过透明溶液介质时，其幅射能量有部分被溶液吸收，一部分透过，所以光线射出溶液介质之后光能被减少。对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点(分子或离子)选择性地吸收某种颜色的光所引起的。如果各种颜色的透过程度相同，这种物质就是无色透明的，若只让一部分波长的光透过，其它波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色，并与被吸收的光的颜色完全互补。任何一种溶液，对不同波长的光的吸收程度是不相等的，一些有色物质可以选择性地吸收一部分可见光区的光的能量而呈现不同颜色，一些物质却能特征性地选择吸收紫外线的能量。物质吸收由光源发出的某些波长的光可形成特定的吸收光谱。由于物质的吸收光谱与物质的分子结构有关，而且在一定条件下其吸收程度与该物质的浓度成正比，所以可利用物质的特定吸收光谱对其进行定性和定量分析。分光光度法是利用各种物质所具有的这种吸收特征所建立起来的分析方法。一、分光光度分析法的基本定律劳伯—比尔定律(Lambert-Beerlaw)是讨论吸收光能与溶液浓度和溶质层厚度之间关系的基本定律，是分光分析的理论基础。劳伯—比尔定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体(一)Lambert氏定律一束单色光通过透明溶液介质时，光能被吸收一部分，被吸收光能的量与溶液介质厚度有一定比例关系(见图2—1)。表达式为这里I0为入射光强度I为通过溶液介质后的光强度L为溶液介质的径长(pathlength)k为吸光系数(absorptioncoefficient)(g·cm-1)(二)Beer氏定律以溶液介质浓度变化代替溶液介质厚度的改变，光能的吸收与浓度改变有类同的关系，即一束单色光通过溶液介质时，光能被溶液介质吸收一部分，吸收多少与溶液介质浓度有一定的比例关系。得出下式：这里C(Concentration)为溶液介质的浓度(g·L-1)将Lambent氏定律和Beer氏定律合并，即(1)和(2)合并为式中A(Absorbance)为吸光度T(Transmittance)为透光度(4)式也可表达为A=εCb…………………………………………..(5)式中ε(epsilon)称之摩尔吸光率(Molarabsorptivity)(mol／L-1cm-1)C(concentration)浓度(mol／L)b(pathlength)溶液样品的长度cm(或比色皿内径长cm)(5)式为lambert—Beer定律的物理表示式，其含义为一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。此式为分光分析法的基本计算式。如果实验中溶液厚度b=lcm则A=εC图2—2表明，在溶液介质厚度一定的情况下，吸光度(A)、透光度(T)和溶液介质浓度(C)之间的关系。摩尔吸光率(ε)实际上是物质在单位浓变和单位厚度下对入射光的吸光度，在一定波长下，ε越大表示物质对光的吸收越强。二、定量的分光光度法分析许多对光有吸收的物质可以直接用分光光度法进行定量分析：一些对光，包括紫外、可见或近红外都无吸收的物质亦可通过和某些化学试剂作用而呈色，在一定的反应条件下和一定的浓度范围内，溶液颜色的深浅(对光吸收的程度)和该溶液中显色物质的浓度呈正比。(一)测定波长的选择使用分光法测定溶液中物质的含量，首先要选择最适单色波长，因为只有以能被溶液吸收的光束作为入射光才能符合Lambert—Beer定律。测定有色物质时，不同颜色的待测溶液，则应选择不同波长的单色光束。在分光光度计上，单色光波长的选择原则一般是使被测溶液的单位浓度的吸光度变化最大，同时还要具有最小的空白及干扰读数，借以获得最高的灵敏度和正确性。最理想的办法是对每种物质的测定都应先傲它的光谱吸收曲线及有关干扰物的吸收曲线，根据这些光谱吸收曲线来选择最佳测定波长。表2—2可供波长选择的参考。(二)利用标准管计算测定物含量最适波长选定以后可进行溶液物质含量的测定。通常都采用对比测定法，即以巳知精确含量的待测物质的溶液作为参考标准物(Cs)和未知待测样品(Cx)用同一方法，在同一条件下、同时进行测定，读取标准物质的吸光度(As)和未知含量的样品吸光度(Ax)，由于标准物质和未知物质是同一物质，其摩尔吸光率(巨)相同和进行测定用的比色皿内径长(b)相同即bs=bx，根据A=εCb式，可得到As=Cs换算成下式Ax=Cx式中Cs是标准管中物质的实际含量，是标准液的浓度与实际用量的乘积；Cx是测定管中物质的实际含量。还应换写到法定单位mmol／L、mg／m1。(三)利用标准曲线进行换算配制一系列不同浓度的标准的溶液(至少五个)按测定管同样方法处理显色，在选定的波长分别测定各管的吸光度(A)，以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度(C)为横坐标，在方格坐标纸上作图，制作标准曲线。以后在同样条件下进行测定时，测定被测溶液的吸光度，从标准曲线上可找出相应的浓度。根据Lambert—Beer定律，标准液的浓度在一定范围内与吸光度呈直线关系，标准曲线是这种直线关系的描述，一般认为，标准曲线范围在测定物浓度的一半到二倍之间，并使吸光度在0．05—1．0范围内为宜。还须注意：曲线制作与测定管的测定应在同一仪器上进行，由于曲线的建立与实验室当时的条件如温度，湿度和气压及电压稳定性等有关，因此标准曲线常因各种变化而需校正或重做。(四)摩尔