单元(扩充)繁殖生物技术

单元（扩充）繁殖生物技术Bio-TecofReproduction•第一节体外受精•第二节发情控制•第三节其它繁殖生物学技术第一节体外受精体外受精是指卵母细胞与精子在体外融合，形成合子的过程。体外受精成功的标志是通过移植产生后代。卵母细胞：体内；体外精子：体外获能•一、卵母细胞•1、体内成熟卵母细胞1）超数排卵：（略，胚胎移植讲）2）卵母细胞采集：在内窥镜的导引下，穿刺成熟卵泡，从卵泡中抽吸卵泡液和成熟卵母细胞。3）镜检：将吸取的卵泡液及卵母细胞置于评皿中，在体视显微镜下（25X），选则合格的卵母细胞，用于体外受精。合格卵母细胞标准：放射冠细胞扩散良好，质地均一，放射冠细胞间透明；透明带清晰；卵母细胞圆形，直径大小适中，细胞质质地均匀，色泽柔和，透明度适中（图－1）。•2、体外成熟的卵母细胞•1）卵母细胞来源•（1）卵巢来源：从屠宰场宰杀的母畜获得卵巢，38°C生理盐水中保温，宰杀后2小时内运回实验室。图－1成熟卵母细胞图•（2）采集卵母细胞－卵丘细胞复合物：用38°C生理盐水洗涤卵巢2次，左手持卵巢，右手持注射器，如图所示，抽取3－5mm卵泡的卵泡液及卵母细胞－卵丘细胞复合物，置于20ml试管内，静置待检。选择3－5mm卵泡的原因是：更大卵泡的闭锁比例可能例高，更小卵泡的发育程度可能低。图－2卵母细胞－卵丘细胞复合物采集示意图•生理盐水配方：NaCl18g，Mill-Q（或三蒸水）2l，青霉素2,000,000IU，链霉素2g。•（3）镜检卵母细胞－卵丘复合物：用吸管吸取经静置后试管底部的混合物于平皿中，用吸管铺平，在实体显微镜下用吸管检出卵母细胞－卵丘复合物，置于另一平皿中，用洗涤液在实体显微镜下洗涤2次，在洗涤过程中要剔除不合格的卵母细胞－卵丘复合物。选择合格的卵母细胞－卵丘复合物非常重要，否则将降低卵母细胞的成熟比例。•卵母细胞－卵丘复合物分类标准a、分类依据：卵母细胞的直径、形状、质地的均匀度、色泽；透明带的完整性；卵丘细胞围绕卵母细胞的完整性、数量、扩散程度、色泽。一般分为4级，1、2级为合格；3、4级为不合格。•一级：卵母细胞：直径120μm，圆形，质地均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密、完整，质地均匀。•二级：卵母细胞：直径120μm，圆形，质地均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密，但不完整，质地均匀。•三级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、不完整，质地均匀。•四级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地不均匀。卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、不完整，质地不均匀。•（4）卵母细胞－卵丘复合物体外成熟体外成熟大多采取液滴或试管培养。液滴培养的优点是培养液不蒸发，渗透压稳定，缺点是培养液中的脂溶性物质能溶于覆盖的石蜡油；试管培养的缺点是培养液容易蒸发而致渗透压提高。一般来说，采用液滴培养普遍，因此，这里介绍液滴培养。•a、制作体外成熟培养液滴在一次性利用的平皿（3－6cm）中，用加样器整齐、小心地加入液滴（大多采用50μl液滴），然后用石蜡油覆盖，在CO2培养箱中平衡2小时（图－3）。•b、培养牛：在平衡后的每个液滴中用吸管加入5－10个卵母细胞－卵丘复合物，39°C、5％CO2、湿润环境中培养24小时，卵母细胞成熟，细胞核达到第二次减数分裂。猪：在平衡后的每个液滴中用吸管加入5－10个卵母细胞－卵丘复合物，在39°C、5％CO2、湿润环境中培养40－48小时，卵母细胞成熟，细胞核达到第二次减数分裂。c、成熟卵母细胞的检查外观检查：卵母细胞在成熟过程中，卵丘细胞扩散，因此，卵丘细胞扩散，说明卵母细胞可能成熟（图－4）。卵母细胞核成熟：在卵母图－3液滴示意图细胞成熟过程中，卵母细胞启动第一次减数分裂，依据其核型进行鉴定。在成熟过程中，核型可分为核膜期、染色质浓缩期、核膜消失期、第一次减数分裂中期、第一次减数分裂后期、第二次减数分裂中期。各期特点如下（图－5）：核膜期：经染色后可见完整的核膜。染色质浓缩期：染色质染色很深、均一，此为卵母细胞已经启动第一次减数分裂。核膜消失期：核膜从断续到完全消失。第一次减数分裂中期：染色体分为两组。此时标志着卵母细胞核已经成熟。第二次减数分裂中期：染色体分为两组，可见第一极体。卵母细胞质成熟：细胞质成熟较难鉴定，因此，通常只检查细胞核的成熟。•卵母细胞核染色（图－6）制片：压片。固定：固定液乙醇：乙酸＝3：1，24h染色：1％地衣红，40％乙酸镜检：光学显微镜图－6制片、固定、染色示意图•液体制备•二、精子体外获能•1、牛冷冻精液：Swimming-up•2、猪精液：高Ca离子孵化•3、绵羊精液：肝素＋羊血清孵育法•三、体外受精•1、制备体外受精液滴：35＋15μl液滴•2、体外受精：10卵子，加获能精子至106精子/ml•3、培养：5%CO2，38°C培养12小时。