PCR在食品微生物测定实例-PCR快速检测沙门菌

食品微生物分子生物学测定PCR快速检测沙门菌沙门菌是一种常见的污染食品的致病菌，该菌的常规检测主要采用微生物培养法，需经过选择性增菌、分离培养、革兰氏染色镜检等步骤，以及一系列生化和血清学检测，整个过程一般需要4-7天。PCR技术作为一种快速、准确检测生物样品中遗传物质的检测方法，为食品中沙门菌的快速检测提供了新的技术手段，本方法可以在12-24h之内即可得出可靠的结果。实验原理：沙门菌染色体上含有其特有的侵袭基因InvA，可以以此基因设计一对引物，利用Taq酶在合适的条件下，以4种单核苷酸（dNTP）作为原料进行高效循环扩增，最终得到特异性的PCR扩增DNA产物，此产物可以通过琼脂糖凝胶检测进行确认。实验材料：四硫酸盐胱氨酸增菌液鼠伤寒沙门菌标准参考株TaqDNA聚合酶dNTP10×PCRbuffer琼脂糖溴化乙锭（EB）1×TAE电泳缓冲液（0.04MTris-Cl、0.01MEDTA），溴酚蓝加样缓冲液DNAmarker1.5mlEP管0.2mlPCR小管微量加样器和枪头PCR反应扩增仪琼脂糖凝胶电泳仪紫外自动成像系统实验步骤：1.将待检测食品制作成匀浆液接种于四硫酸盐胱氨酸增菌液中培养6h，取100μl培养物于100°C加热预处理5min，制作成DNA粗提物用于检测。2.PCR体系的构建：将PCR反应的6种组分加入到0.2ml的PCR小管中组分体积Taq酶1μldNTP2μl10×PCRbuffer5μlPCR引物2μl待测样品5μlddH2O35μl总体积50μl3.PCR反应：将添加好PCR组分的PCR小管以简易离心机进行离心，离心结束后，放入PCR仪中。将PCR反应扩增仪设定程序：94°C预变性5min，PCR循环：94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸45s（循环35次），循环结束后，72°C延伸7min。结束PCR反应，样品4°C保存。4.PCR产物的琼脂糖电泳分离：制作1.5%的琼脂糖凝胶，凝胶中添加（1ng/ml的EB），待凝胶冷却后，将凝胶置于浸泡了TAE的电泳仪中，将PCR样品上样于凝胶加样孔中，电泳30min-1h，经EB染色后，紫外自动成像系统观察DNA条带。5.结果分析：阳性对照再280bp位置出现红色DNA条带，阴性对照无此条带，食品样品中如出现此条带，则为沙门菌阳性。