SecureSocketLayer的应用

LOGOPCR（PolymeraseChainReaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术，是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。前言它能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。前言主要内容PCR技术简史PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型。1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技术，二是体外扩增技术。一、PCR技术的发展历程DNA，生命的蓝图……DNA的复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNA的复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶DNA的复制1971年，Khorana（美国MIT教授，1968年诺贝尔医学奖得主）提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……核酸体外扩增的设想故事发生在1983年的春夏之交1983年4月，KaryB.Mullis（凯利·穆利斯）在Cetus公司人类遗传研究室工作期间，他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车前去北加利福尼亚红树县(Redwoodcountry)乡下别墅的路上构思了PCR，即用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……聚合酶链反应的发明经过两年的努力，1985年Mullis发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年。Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一。PCR技术的发展历程用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制。它是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。二、PCR技术的基本原理PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CPCR循环第一步——加热变性靶序列靶序列1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCR技术的基本原理PCR循环第二步——引物与靶序列退火2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCR技术的基本原理PCR循环第三步——引物延伸3.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。PCR技术的基本原理第1个PCR循环完成后–得到两个拷贝的靶序列PCR技术的基本原理4.在合适的条件下，这种循环不断重复，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。理论上讲经过30次扩增反应，DNA扩增倍数为106~109。因此可用微量样品获取目的基因。PCR技术的基本原理30次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555PCR基本工作原理Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。PCR基本工作原理以上变性、退火、延伸三个过程组成一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，经过n轮循环后，靶DNA的拷贝数理论上呈2n增长，一生二，二生四，四生万物。PCRproductPCR技术的基本原理PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。PCR扩增终产物序列是介于两个引物5’端之间的区域。PCR产物三、PCR反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）（一）引物（primer）是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。引物：决定PCR反应的特异性PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。上游引物与目的DNA５′端序列相同；下游引物与目的DNA３′端序列互补。引物设计的原则①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右②引物扩增跨度：以200-500bp为宜③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜④避免引物内部出现二级结构⑤引物3′端的碱基一定要与模板DNA配对⑥引物的特异性Primerpremier5.0oligo6.0软件（二）酶（TaqDNApolymerase）PCR发明初期所用的DNA聚合酶为大肠肝菌DNA聚合酶I的Klenow片段。由于该酶不耐热，因此，每次DNA变性后都要重新加入Klenow酶。使这一过程耗时，费力，且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使上述问题得以解决，PCR能高效率的进行，并使PCR反应的自动化成为可能。目前有两种TaqDNA聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成（三）dNTP的质量与浓度是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。dNTP溶液具有较强的酸性，使用时应以NaOH将pH调至7.0～7.5。在PCR反应中，dNTP浓度应在20～200umol/L。dNTP的浓度过高可加快反应速度，同时也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，但可提高反应的特异性。4种dNTP要求浓度相等，以减少错配误差并提高使用效率。PCR的反应模板可以是DNA，也可以是RNA。对于RNA，在PCR反应之前，应先将其逆转录为cDNA，然后再进行正常的PCR循环。核酸标本来源广泛，常见的病原体标本有病毒、细菌、真菌等。病理生理标本有细胞、血液、绒毛、羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养细胞系。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。还可以从考古样品制备核酸模板。（四）模板（靶基因，targetgene）模板（靶基因，targetgene）无论标本来源如何，待扩增核酸都需部分纯化，使核酸标本中不含任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。对标本进行处理的目的就是除去许多影响PCR反应的杂志，暴露模板DNA。在制备RNA模板时，要注意防止RNA降解。DNA模板的制备相对容易。（五）Mg2+浓度TaqDNA聚合酶发挥活性需要Mg2+参与。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。四、PCR反应条件的选择PCR反应条件:温度时间循环次数（一）温度与时间的设置标准反应中变性-退火-延伸三个温度点：双链DNA在90～95℃变性lmin;再迅速冷却至40～60℃引物退火30～60sec并结合到靶序列上;然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸1min。（二）循环次数循环次数决定PCR扩增程度循环次数主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多PCR通用操作程序①向一微量离心管中依次加入各成分，双蒸水补至终体积。②PCR③琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物五、PCR的特点强特异性PCR反应的特异性决定因素为：1.引物与模板DNA特异性的结合；2.碱基配对原则；3.TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；4.靶基因的特异性与保守性灵敏度高1.皮克（pg=10-12）量级扩增到微克（ug=10-6）水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.细菌检测的最小检出率为3个细菌PCR的特点简便、快速1.一次性加好反应液，2～4小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低1.血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等2.组织的粗提DNA六、PCR技术的应用①遗传性疾病的基因诊断②PCR在检测艾滋病中的应用③检测癌基因④PCR在法医学上的应用（犯罪现场标本、分析个体识别和亲子鉴定）⑤PCR技术在分子生物学中的其它应用七、PCR技术的类型1）不对称PCR2)反向PCR(reversePCR)3）多重PCR4）筑巢PCR5）锚定PCR6）定量PCR7）原位PCR8）RT-PCTLOGO