PCR技术(包含引物设计)

聚合酶链式反应（PCR）原理：DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火(复性）-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术分类（常用）（1）反向PCR技术(InversePCR,IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。（2）锚定PCR技术(AnchoredPCR,APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。（3）不对称PCR技术(asymmetricPCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度,常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。（4）反转录PCR技术(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)：当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。应用非常广泛,无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。（5）巢式PCR技术(NEST-PCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带,此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些,且用量较少,同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度,这样在第一次PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物,经过若干次循环,待外引物基本消耗尽,无需取出第一次PCR产物,只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤,同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR，主要用于极少量DNA模板的扩增。（6）多重PCR技术(multiplexPCR)：在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。（7）重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。（8）原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。（9）荧光定量实时PCR技术反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，最终DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n表示循环次数。平均扩增效率理论值为100%，但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，此效应称平台期，与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。进入第二个反应周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（长产物片段）结合引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，故这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内，形成长短一致的短产物片段。由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计，使得PCR的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA片段供分析、监测。反应五要素---引物、模板、DNA聚合酶、四种dNTP、Mg2+（1）引物设计①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。【引物的GC含量和Tm值应该协调：Tm=4（G+C）+2（A+T）】④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3‘端也不能发生错配，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。5’端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。⑧引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。（2）DNA聚合酶：目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量0.5-2.5U/50ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。（3）dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。（4）模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。RT-PCR--是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。总RNA提取（-70℃保存）Trizol法：1、取组织100㎎于玻璃匀浆器中，加入1mlTrizol冰上抽打匀浆（边匀浆边暂停）2、移入1.5mlEP管中，颠倒混匀，室温保存5min3、加氯仿0.2ml（总体积的1/5），振荡混合，室温放置5min4、4℃，离心12000rpm，15min5、取上层液相（约400μl）移入一新1.5mlEP管中，加等体积异丙醇（约400μl）,振荡混合，室温保存10min6、4℃，离心12000rpm，10min7、弃上清液，加1ml75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合8、4℃，离心7500rpm，5min9、弃上清液，室温放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、加20ulDEPC水至EP管中，在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解（可保存在液氮或低温冰箱-70℃）测RNA浓度：走RNA变性电泳观察18s、28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值调零：750ulDEPC水测量：745ulDEPC水+5ulRNA总RNA浓度=OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml=OD260×40×150ug/ml=OD260×6ug/ulA1/A2应在1.8-2.0之间注意：提取RNA的质量主要是要通过260/280的比值看是不是在2.0左右，当OD260/OD2801.8时提示有蛋白或酚的污染，需要进一步纯化RNA；还要跑胶看看28s、18s、5s的三条带是不是清晰，一般质量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一条5s的应该比较淡。②逆转录RT（cDNA：一周内-20℃保存，长期-70℃保存）RT反应体系：20ul体系第一步：约20分钟RNA抽提物5μlRadome引物2μlRNAsin0.5μl1、65℃15分钟2、立即放入冰浴第二步：约2小时RNAsin0.5μl10mMdNTP1μl5×RT缓冲液4μl25mMMgCl24μlAMV3μl1、37℃1.5小时2、94℃5-10分钟3、反应物保存于-20℃或进行PCR③聚合酶链反应PCR(产物-20℃保存)PCR反应体系：100μl体系约4.5小时约5小时25mMMgCl22μl3μl10×PCR缓冲液5μl5μl10mMdNTP1μl1μl10pmol/μl上游引物2.5μl2.5μl10pmol/μl下游引物2.5μl2.5μlcDNA模板2.5μl5μlddH2O34μl30μlTaq酶0.5μl1μl轻质石蜡油50μl50μl1、94℃2分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为第一个步1个循环2、94℃45秒，55℃40秒，72℃1分钟为第二步30/40个循环3、72℃10分钟4、取出后4℃保存，5分钟后-20℃保存或走电泳④琼脂糖凝胶电泳：约1.25小时1、配制0.5×TBE电泳缓冲液300ml2、配制凝胶浓度1.7%（40ml0.5×