PCR技术在动物医学方面的研究进展

PCR技术在动物医学方面的研究进展【摘要】PCR技术是20世纪80年代中期发展起来的一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已在分子生物学检测与研究中得到广泛应用。本文扼要介绍了PCR技术的基本原理，并对该技术在动物疾病诊断和免疫预防等应用方面的新进展作了论述。【关键词】PCR技术；扩增；DNA片段AdvancesinPCRtechnologyinmedicineanimalsAbstractPCRtechnologyisaninvitroenzymaticsynthesisofthemid-1980sdeveloped,specificDNAfragmentsamplificationmethods.Becauseofitsspecificityandsensitivityanddetectionspeed,accuracyandotheradvantagesofhighstrength,hasbeenwidelyusedinmolecularbiologyandresearch.ThispaperbrieflyintroducesthebasicprinciplesofPCRtechnologyandtheprogressoftechnologyintheapplicationofnewanimaldiseasediagnosisandpreventionoftheimmunizationarediscussed.KeywordsPCRtechnology;amplification;DNAfragments前言聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是1985年Mullis等人发明的一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]，以少量的DNA分子为模板，经过变性、退火、延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子。短短几十年，该技术已经成为最常用，也最重要的分子生物学技术之一。其应用范围从基本的基因扩增，扩展到基因克隆、基因改造、传染病源分析、遗传分析等[2]，甚至扩展到许多非生物领域。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR（mutiplexPCR）技术[3]、实时荧光定量PCR（real-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCR）技术[4]、单分子PCR技术[5]。本文简述近几年PCR技术在动物医学方面的应用进展，使PCR反应的高特异性、高灵敏度、快速、准确、重复性好等优点在其应用领域也在不断延伸[6-7]。因此更广范地也应用于动物医学的研究领域。1.PCR技术的基本原理用PCR技术进行的基因扩增过程，类似于体内DNA的复制过程，是一种非常简单扩增核苷酸的方法。PCR扩增包括：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93-94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[8]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25-30次，DNA可扩增l00万-200万倍[1]。由于新合成的DNA链仍能与引物结合，因此，每条DNA链都可以作为下一轮扩增的模板。这样经过变性、退火、引物与模板结合、链的延伸等周期性过程，使DNA总量呈几何级数增加。经过扩增20个周期，DNA的量将增加2×105倍。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生[9]。最初Cetus公司发明的PCR技术所用的酶为E.coDNA多聚酶Ⅰ的Klenow片段(或称Klenow酶)，其反应温度为37℃，由于这种酶不耐高温，而变性必须在95℃的高温中进行，这种变性温度使多聚酶失活，因此，在每一轮DNA复制过程中，必须加入新的多聚酶，这样不仅操作麻烦，而且容易造成差错。1988年R.KSaiki等人采用从嗜热细菌(Thermusaquaticuis)中分离的耐高温TaqDNA多聚酶用于PCR技术，该酶一是95℃时不变性，二是在65℃下可催化聚合反应，它的使用使PCR技术的发展产生了一次飞跃。近几年，PCR技术又在引物设计、使用标记等方面取得了一系列引人注目的新进展[10]。2.PCR技术在动物医学中的应用2.1在临床检测应用以前对病毒感染的临床检测多采用病毒培养，电镜观察及血清学方法等，不仅诊断时间长，且灵敏度低。黄广明等采集人工感染IBDV的鸡只不同间隔时间法氏囊、胸腺、脾、盲肠扁桃体、肾、肝和腿肌进行了原位PCR检测，同时观察各组织病理变化，对鸡传染性法氏囊病毒早期感染过程研究。黄庚明等用广东禽流感无致病力分离株核蛋白基因片段(NPC)的地高辛标记的cDNA探针，并优化了检测禽流感病毒核酸的探针杂交法，能辨别出非免疫鸡胚和SPF鸡胚尿囊液中的禽流感病毒。PCR技术可使单个未形成病毒颗粒的DNA分子迅速扩增至可用于诊断的量，从而可以大大提高灵敏度并使诊断时间缩短至几小时内。PCR技术在其他微生物和寄生虫的检测应用中也有了很大进展，譬如李树清等[11]利用套式PCR对猪传染性胸膜肺炎进行检测，检测的灵敏度可达113CPU。李辉等[12]首次建立夹心免疫-PCR检测旋毛虫抗原的方法，检测旋毛虫抗原的灵敏度高于传统ELISA方法104倍。张合喜等[13]单核细胞增多性李斯特菌荧光定量PCR检测,结果表明荧光定量PCR比普通PCR特异性强、灵敏度高、重现性好,可以定量、快捷地应用于检测单核细胞增多性李斯特菌。2.2在免疫预防上应用目前，我国控制疫病的最有效措施仍然是接种疫苗。随着常规疫苗的广泛使用，另一种新的问题也随之产生，而且已成为今后防制工作必须要解决的问题，这就是疫苗免疫动物与自然感染动物的鉴别诊断问题。因此，研究者们利用PCR等生物技术克隆出编码保护性抗基因制备成疫苗已经成为一种新的发展趋势。自1981年成功地将口蹄疫病毒的抗原性多肽基因VP3克隆到大肠杆菌内并制成用于牛和猪的疫苗后，基因工程疫苗又成功地应用于猫白血病疫苗以及预防猪腹泻病的K88疫苗等的研究。寄生虫抗原十分复杂，常规疫苗的研制十分困难，使得基因工程疫苗的研制成为必然趋势，虽然起步较晚但也取得了一定进展。Pogonka等用重组SO7-沙门氏菌口腔免疫3周龄白来航鸡，2周后测到了抗SO7的特异性抗体，抗体水平维持6周。用小鼠动物模型进行猪囊尾蚴病的免疫试验，两组免疫小鼠的减虫率分别为96.9%和98.4%，该疫苗可同时激发动物的体液免疫和细胞免疫反应，增强机体的免疫调节功能及杀伤性T淋巴细胞功能，有望达到商品化生产。2.3在水产上的应用基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-timePCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[14-16]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[17]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer等[18]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。3.展望传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用；未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。随着动物医学的不断发展，PCR技术凭着具有简单、快速、灵敏、特异性强等优点引起畜牧兽医科研工作者的广泛关注，并迅速在多个领域中得到推广和应用。随着PCR技术的不断发展和完善，尤其是其自动化的实现，应用前景必将更加广阔。参考文献[1]常世敏.PCR在食品微生物检测中的应用[J].邯郸农业高等专科学校学报，2004,21（4）：23-25.[2]BrennerS.,etal.Proc.NatlAcadSci,1992,89:5381-5383[3]侯立华,黄新,朱水芳，等.双色荧光多重PCR技术及在禽流感病毒检测中的应用[J].生物技术通报,2010（1）：168-172.[4]查锡良.生物化学[M].7版.北京：人民卫生出版社,2009：483-485.[5]张杰道.生物化学实验技术PCR技术及应用[M].北京：科学出版社，2005：12-18.[6]唐永凯，俞菊华，徐跑，等.实时荧光定量PCR技术及其在水产上的应用[J].中国农学通报，2010（21）：422-426.[7]吴学贵.LPS刺激点带石斑鱼免疫相关基因的克隆与组织表达差异性分析[D].海口：海南大学，2011.[8]谢海燕.黑线仓鼠LHR部分序列克隆及组织器官的表达差异[D].曲阜：曲阜师范大学，2011.[9]金宇良.PCR技术的研究进展[J].现农业科技,2010(10):47-48.[10]刘娣琴.PCR技术在动物医学方面的研究进展[J].国外畜牧-猪与禽,2013(7):101-102.[11]李树清,易建平,胡永,等.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的套式PCR检测[J].2005,27(3):217-222.[12]李辉,许汴利,赵旭东,等.夹心免疫-PCR检测旋毛虫抗原的方法[J].2005,21(9):769-775.[13]张合喜,饶晓红.单核细胞增多性李斯特菌荧光定量PCR检测[J].新乡医学院学报,2005,22(2):87-89.[14]唐永凯,俞菊华,刘波,等.翘嘴红鲌肝脏G6Pase催化亚基的克隆以及摄食和饲料中碳水化合物对其表达的影响[J].水产学报，2007，31（1）：45-53.[15]刘波，谢骏，苏永腾，等.高碳水化合物日粮对翘嘴红鲌生长、GK及GKmRNA表达的影响[J].水生生物学报,2008,32（1）：47-53.[16]俞菊华,戈贤平,唐永凯，等.碳水化合物、脂肪对翘嘴红鲌PEPCK基因表达的影响[J].水产学报,2007,31（3）：369-373.[17]孙淑娜，桂永浩，宋后燕，等.叶酸拮抗剂甲氨喋呤导致斑马鱼心脏发育异常及BMP2bHAS2表达下调[J].中国当代儿科杂志,2007,9（2）:159-163.[18]SAWYERSJ，GERSTNERKA，CALLARDG.Real-timePCRanalysisofcytochromeP450aromataseexpressioninzebrafish：genespecifictissuedisyribution,sexdifferences,developmentalprogramming,andestrogenregulation[J].Generalandcomparativeendocrinology,2006,147(2)：108-117.