PCR的原理与应用

第二章PCR技术的原理及应用故事发生在1983年的春夏之交KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……Mullis的第一个PCR实验•1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。第一种高温菌DNA聚合酶的分离美国黄石国家公园Thermusaquaticus•TheThermusaquaticusDNApolymerase•Taq•Notpermanentlydestroyedat94ºC•Optimaltemperatureis72ºC耐高温DNA聚合酶的种类•TaqDNA聚合酶(Thermusaquaticus，Cetus/Roche)•TthDNA聚合酶(Thermusthermophilus，Toyobo)•PfuDNA聚合酶（Pyrococcusfuriosus，Stratagene）DeepVentDNA聚合酶(Bio-labs）•TflDNA聚合酶（Thermusflavus，Promega)•TliDNA聚合酶(Thermococcuslitoralis，Promega)VentDNA聚合酶(Bio-labs）•PwoDNA聚合酶(Pyrococcuswoesei，Roche)•PfxDNA聚合酶(Thermococcuskodakaraensis,Invitrogen)•DynazymeDNA聚合酶（Thermusbrockianus，Finnazyme）•FDDNA聚合酶(Thermussterophilus？，复旦大学)•Tma,Tne,KOD,……PCR仪器的变迁•三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）•电加热块＋自来水冷却（PE，1988）•电加热块＋内置循环液冷却（PE，1989）•三个加热块＋机械手（Stratagene，1994）•半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）•温度梯度,荧光检测(如Roche的Lightcycler)•风加热•Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况•1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）•现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）PCR的发展史•1983年春，Mullis发展出PCR的概念；•1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；•1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断；•1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；•1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。•1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；•1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，TaqDNApolymerase，这是85年春天Mullis建议做的；•1988年，第一台PCR仪问世；•1991年，HoffmanLaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。PCR不只是一个方法改进•Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；•到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；•Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。PCR相关的术语和产品层出不穷•T-vector•HotStartTaq•RT-PCR•RAPD-PCR•DDRT-PCR•LM-PCR•InversePCR•NestedPCR•Real-timePCR•RACE•FlowchipPCR•TAS•MultiplexPCR•ImmunoPCR•AsymmetricPCR•LP-PCR•NASBA•RecombinantPCR•AFLP•SSCP•InsituPCR•TaqMan/SYBRgreen1stcycle2ndcycle3rdcycle过程变性引物退火DNA复制（一）PCR的基本原理（二）PCR的种类1.普通PCRPCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察3-4小时PCR具有极高的灵敏度样品正对照负对照标准分子量污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。用紫外灯破坏污染物也是一个办法（二）PCR的种类2.RT-PCR：反转录PCR(reversetranscriptase-PCR)•原理：RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。•特点：作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异性引物(GSP)中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。•应用：RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，分析基因的转录水平，细胞中RNA病毒的含量，直接克隆特定基因的cDNA序列。两步法RT-PCR示意图一步法RT-PCR示意图两步法RT-PCR一步法RT-PCR起始第一链cDNA合成使用：起始第一链合成使用Oligo(dT)，随机六聚体，GSP引物GSP引物优点优点•灵活•方便引物选择扩增酶同逆转录酶预先混合扩增酶的选择转管步骤少，减少污染可能性•困难RT-PCR的优化能力•高灵敏度•适用于在单个样品中检测几个mRNA•适用于大量样品分析一步法和两步法RT-PCR的比较EcoRI寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R6寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R6mRNA(A)n(T)12-18(A)n(A)n(T)12-18R6R6R6R6R6R6第二链合成(A)n(T)12-18(A)nR6R6R6R6R6R6(A)n(T)12-18EcoRI加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级cDNA合成完毕，准备连接第一链合成cDNA合成过程示意图cDNA序列的克隆（二）PCR的种类2.NestedPCR：巢式PCR•原理：利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。•优点：由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。•应用：一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。NestedPCR原理示意图FirstPCRSecondPCR（二）PCR的种类3.InversePCR：反向PCR•原理：用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。•优点：可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。•应用：一般应用于未知序列的扩增，有时也用于定点突变。InversePCR原理示意图（二）PCR的种类4.PCR-RFLP:多聚酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthPolymorphism，RFLP)•原理：PCR产物－限制性内切酶切－多态性分析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。•优点：具有分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析与比较,微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断等。•局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变的情况下，一次只能完成一个特定位点突变筛选，检测效率低。PCR-RFLP原理示意图5.PCR-SSCP：聚合酶链反应一单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism)•原理：是将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。•特点：刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。1993年起用EB染色法显示DNA带型。优点：检测基因变异，具有操作简便、快速、不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。（一）PCR的种类PCR-SSCP示意图从定性到定量的革命聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。普通PCR定量分析的困惑PCR产物生成曲线log[DNA]Cycleslog[DNA]Cycles不同样品有不同的生成曲线•实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。•实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。RealTimePCRandConventionalPCRVS5’3’5’3’5’3’5’3’TaqTaq5’3’RepeatDenaturationPrimerAnnealingElongation常规PCRProcessIntheory,productaccumulationisproportionalto2n,wherenisthenumberofamplificationcyclerepeatsRealityvs.TheoryAmplificationisexponential,buttheexponentialincreaseislimited:AlinearincreasefollowsexponentialEventuallyplateausTheoreticalRealLifeLogTargetDNA定量的最佳时期Quantitativeinformationcomesfrommonitoringtheearlystagesofamplification