Slug-siRNA转染对胰腺癌细胞生长的影响

Slug-siRNA转染对胰腺癌细胞生长的影响崔海宁张克君*吴幸王正文海南医学院附属医院普外科517001[摘要]目的研究Slug基因沉默后对体内胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响方法构建靶向抑制Slug的siRNA表达载体，瞬时转染CaPan-2细胞。免疫组织化学、RT-PCR和Westernblot法检测细胞Slug表达的变化，MTT检测细胞增殖，AnnexinV-FITC/PI、Hoechst33258和PI双染色染色了解细胞凋亡的变化。结果：成功构建了pGenesil-1-Slug-siRNA(pSlug-siRNA)和pGenesil-1-Neg-siRNA(pNeg-siRNA)表达质粒；质粒瞬时转染胰腺癌CaPan-2细胞72h后，细胞内Slug表达受到明显抑制。Slug-siRNA细胞的生长受到抑制，并且细胞凋亡率明显增加结论：Slug-siRNA抑制Slug表达后可以在体外促进CaPan-2细胞凋亡并抑制细胞的增殖。关键词：Slug;小干扰RNA;瞬时转染;增殖;凋亡；胰腺肿瘤；CaPan-2Slug是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因，是PUMA基因的强烈抑制剂【1-2】。本文旨在研究Slug基因沉默后对胰腺癌细胞的增殖和凋亡的影响，探讨胰腺癌基因治疗的新靶点。材料和方法1材料和试剂：人胰腺癌细胞株PaCan-2购自上海细胞所、pGenesil-1质粒购自Austin,USA、感受态大肠杆菌DH5α购自武汉晶赛生物工程技术公司、限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4连接酶为Promega公司产品、LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品、四甲基偶氮唑蓝(MTT)为sigma公司产品、BCA蛋白浓度测定试剂盒及敏感曝光试剂盒为Pierce公司产品；Slug多克隆抗体及G3PDH抗体为SantaCruz公司产品、山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗为北京中山公司产品。凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎公司;siRNA的转录模板由上海生工合成，合成的序列分别为Slug-siRNA(GenBankaccessionno.AK223368,目的片段作用于Slug编码区的523-541位，下划线表示19bp)sense:5-GATCCGACTACAGTCCAAGCTTTCTTCAAGACGTTGATGTCAGGTTCGAAAGTTTTTGAATTCA-3antisense:3-CTAGGCTGATGTCCAGGTTCGAAAGAAGTTCTGCAACTACAGTCCAAGCTTTCAAAAACTTAAGT-5;Negative-siRNA:(与人类编码基因序列无同源性的碱基序列,使用BLAST方法排除):sense:5-GATCCCAGACTTGAAACCCGTTTcTTCAAGACGcTAGTgTCGGATTAAACGGTTTTTGAATTCA-3;antisense:3-GATAGGTTGGACTTGTTTCTAAGTTCTGCACATCCCATGGGCAATTTGAAAAACAGCTGTGCGA-5;2质粒的构建：合成的siRNA转录模板长度为64bp,在序列中间为加入9个茎环序列分隔的正反向靶序列，尾端插入5个TTTTT作为终止序列，上游和下游分别加了BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，pGenesil-1质粒经BamHⅠ、HindⅢ酶切后与合成的表达模板DNA片段用T4DNA连接酶连接（16O°C，8h),转化DH5α菌株,涂卡那霉素琼脂平板,挑选阳性克隆,扩增并提取质粒,用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆送上海英骏生物公司测序,测序正确后大量提取质粒.方法1细胞培养：胰腺癌细胞CaPan-2购自中科院上海细胞所，细胞用含10%胎牛血清的RPMR1640培养基培养，细胞培养条件为37°C恒温，饱和湿度和5%CO2，每2-3天传代一次，指数生长的细胞为实验对象。2细胞瞬时转染:在6孔培养板中常规接种CaPan-2细胞,待细胞70-80%融合后,经LipofectamineTM2000介导质粒转染CaPan-2细胞72h(按试剂盒说明操作)。3AnnexinV-FITC/PI染色:收集三组细胞,每组设三个复孔。用去离子水按1:4稀释结合缓冲液。用4℃预冷的1×PBS洗细胞2次，用250µl结合缓冲液重悬细胞，调节其浓度为1×106/ml。取100µl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5µlAnnexinⅤ/FITC和10µl20µg/ml的PI溶液。混匀后于室温避光孵育15min。在反应管中加入400µlPBS，混匀，流式细胞仪（FACS）分析,激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。4MTT测定:取对数生长期的三组细胞用0.25%Trypsin-EDTA消化成单细胞悬液接种于96孔培养板，104细胞/孔,每孔加入200µl含10％FBS的高糖DMEM液，分别培养0,12,24,36,48,72h，每组设3个复孔。在每个时间点加入5mg/ml的MTT液（20µl/孔）,继续培养4h，培养条件同上。吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150µl／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10min，使结晶物充分溶解，酶标仪检测各孔A570值，绘制连续5d的细胞生长曲线。实验重复3次，结果用x±s表示。5Hoechst33258和PI染色:Hoechst33342可以穿透细胞膜，染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。PI不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，PI可以染色坏死细胞。上述两种染料双染后，使用荧光显微镜观察，正常细胞为弱红色荧光＋弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光＋强蓝色荧光，坏死细胞为强红色荧光＋强蓝色荧光。三组细胞接种于6孔板中，72h取出玻片，用1×PBS洗一次。加入细胞染色缓冲液。加入5µlHoechst染色液。加入5µlPI染色液。混匀，4℃孵育30min。PBS洗涤一次。避光干燥后在荧光显微镜下检测红色和蓝色荧光。6免疫组化检测：将盖玻片加入6孔板中,3组细胞分别铺板到6孔板中培养72h。1×PBS洗涤1次,10%中性福尔马林4℃固定过夜。次日，吸去固定液，取出玻片，晾干备用。30%H2O21份+甲醇50份混合,室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次。后续步骤参考说明书。7WesternBlot检测蛋白的表达：按说明书方法进行操作，提取细胞总蛋白进行WesternBlot检测:SDS-PAGE分离胶浓度为12%,积层胶浓度为5%,上样量为15μg.L-1;SDS电泳:恒流,每块板20～40mA,电泳时间约2h;转膜:恒流,每张膜42mA,时间:3.5h。8RT-PCR：按TRizol试剂盒(Invitrogen公司)说明书操作提取不同组细胞总RNA,取1μgRNA模按RT试剂盒(Takara公司)说明书反转录得到cDNA。引物序列：Slug(414bp):R:5'-CGTCACGACGGGTCAGAT-3',F:5’-ATCTGACCCGTCGTGACG-3’反应条件：50℃30分钟,94℃2分钟,94℃30秒,55℃30秒,72℃1分钟,72℃延伸7分钟，28循环。以上引物由赛百盛公司合成。取5μL反应产物在含EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用SYNGENE型凝胶成像系统照像,以目的基因条带和内参G3PDH条带扫描峰下面积之比作为目的基因的相对表达量。试验重复3次，数据以x±s表示。结果1Slug-siRNA抑制Slug基因和蛋白表达：Slug检测发现，CaPan-2/pSlug-siRNA细胞内Slug蛋白和Slug-mRNA表达已被显著抑制，而CaPan-2/pNeg-siRNA细胞内Slug蛋白和Slug-mRNA表达无明显变化，提示Slug-siRNA抑制了细胞内Slug的表达。2MTT检测:PaCan-2/pSlug-siRNA和PaCan-2/pNeg-siRNA两组细胞生长能力差异无统计学意义(P0.05)。而实验组细胞的生长能力较低，细胞增殖明显滞后于前两组细胞，差异有统计学意义(P0.05)。3AnnexinV-FITC/PI检测FCM显示转染72h后，PaCan-2/pSlug-siRNA和PaCan-2/pNeg-siRNA细胞的凋亡率均较低，差异无统计学意义(P0.05)。Slug-siRNA组细胞的凋亡率明显增高，与其他两组组比较，差异有统计学意义(P0.05)。5Hoechst33258和PI双染色检测细胞凋亡：荧光显微镜下，对照组和CaPan-2/pNeg-siRNA组细胞主要表现为弱红色荧光＋弱蓝色荧光，两种荧光在强度和比例上无明显差别。CaPan-2/pSlug-siRNA组细胞主要为蓝色容光，说明细胞的凋亡现象明显。讨论PUMA是2001年发现的bcl-2家族BH-3亚家族中的成员，是p53介导的下游促凋亡基因，PUMA活化后，导致下游的bax活化，细胞色素C释放和caspase反应，最终导致细胞凋亡[3-5]。Slug是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因，最初发现它与细胞的生存活力有关[6]，后来发现与促癌转移有关[7-8]。最近研究发现[1-2,9-10]，Slug是PUMA的强烈抑制剂，Slug通过抑制PUMA表达而对细胞凋亡起阻碍作用，而抑制Slug表达后可解除Slug对PUMA表达的抑制，发挥了PUMA的促凋亡作应。本研究利用RNA干扰技术探讨了Slug沉默后对胰腺癌CaPan-2细胞凋亡和增殖的影响。实验发现Slug-siRNA转染沉默Slug后，细胞内Slug的蛋白和基因表达几乎完全被抑制，同时伴随着细胞增殖能力下降，细胞凋亡率的明显提高，说明Slug沉默有效地抑制体外胰腺癌细胞生长。转染了阴性对照质粒的细胞与正常细胞相比Slug蛋白的抑制及体内外增殖和凋亡方面均无明显差异，说明该质粒可以安全有效地应用。本研究初步证明了利用RNA干扰技术针对Slug靶点能抑制胰腺癌细胞的体外生长，为胰腺癌的基因治疗提供了一个新的切入点。参考文献[1]WuWS,HeinrichsS,XuD.Slugantagonizesp53-mediatedapoptosisofhematopoieticprogenitorsbyrepressingpuma.Cell.2005;123(4):641-53[2]VanniniI,BonafeM,TeseiAShortinterferingRNAdirectedagainsttheSLUGgeneincreasescelldeathinductioninhumanmelanomacelllinesexposedtocisplatinandfotemustine.CellOncol.2007;29(4):279-87[3]YuJ,ZhangL,HwangPM,etal.PUMAinducestherapidapoptosisofcolorectalcancercell[J].MolecularCell,2001,7:673-682[4]Nakano,K.H.Vousden.PUMA,anovelproapoptoticgene,isinducedbyp53[J].Mol.Cell,2001,12(7):683–694.[5]ChipukJE,Bouchier-HayesL,KuwanaT,etal.PUMAcouplesthenuclearandcytoplamicproapoptosisfunctionofp53[J]Science,2005,309(5741)1732-1735[6]Barrallo-GimenoA，NietoM.A.TheSnailgenesasinducersofcellmovementandsurvival:implicationsindevelopmentandcancer.Developme